蜗牛匀浆液直肠给药对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用

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1、蜗牛匀浆液直肠给药对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用范志源;余秋雨;李欢;苏小娇;盛艳梅 【期刊名称】中国医药导报【年(卷)，期】2019(016)022【总页数】5页(P17-20,25) 【关键词】蜗牛匀浆液;溃疡性结肠炎;直肠给药;保护作用 【作者】范志源;余秋雨;李欢;苏小娇;盛艳梅 【作者单位】成都医学院药学院四川成都610500【正文语种】中文【中图分类】R574.62溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)主要表现为直肠与结肠黏膜的炎性溃疡 性病变，严重可累及黏膜下层，临床表现为腹泻、腹痛、黏液便及血便等症状1。 目前，UC治疗研究文献中中药和中西结合研究约占80%，

2、应用较为广泛，且相对 于化学药物，不良反应相对较少2，其中尤以中药直肠给药治疗起效较快，效果 最为明显3。直肠可以使药物与溃疡面直接接触，持续高浓度作用于病灶，减少 了炎症因子的渗出，取得了良好效果4。中药蜗牛为巴蜗牛科巴蜗牛属动物同型巴蜗牛Bradybaena similaris(Ferussde)、华蜗牛属动物华蜗牛 Cathaica fasciola( Draparnaud)及其同 科近缘种的全体，中药大辞典载其归膀胱、胃、大肠经。主治风热惊痫 痔疮，脱肛等”5。早在古代的西方医学中，使用碾碎的蜗牛应用于伤口6。蜗 牛肉富含蛋白质、必需氨基酸和多不饱和脂肪酸等营养物质，并且蜗牛分泌的黏液

3、 中提取出的尿囊素可促进细胞再生，应用于烧烫伤7，黏液组分能促进胶原蛋白、 弹性蛋白和真皮成分的形成，修复光老化，减少自由基造成的伤害8-9，并显示 出较好的抗炎、促愈合作用10-11。因此，本实验拟采用含有蜗牛组织和黏液的 匀浆液，对其直肠给药用于治疗UC的效果进行初步研究，以期为后续应用提供实 验基础。1材料与方法1.1材料及仪器蜗牛（自行捕捉，经鉴定为巴蜗牛科巴蜗牛属同型巴蜗牛）；冰乙酸（成都市科龙 化工试剂厂，批号：2016041301），水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号： 20160316），乙醚（四川西陇化工有限公司，批号：20170524），甲醛溶液 （成都市科龙化工试剂厂，

4、批号：2016033102）；通用台式离心机（赛默飞世尔 科技中国公司），分析天平（Sartorius，BP211D型），优谱超纯水器（成都超 纯科技有限公司，UPH-1-20T型）等。1.2实验动物与分组SPF级雄性SD大鼠40只，67周龄，体重180 220 9，购自四川成都达硕生 物科技有限公司，动物许可证号SCXK （川）2015-030,分笼饲养，自由摄食饮 水。根据随机数字表将实验动物分为空白组、模型组、高剂量组与低剂量组，每组 10只，各组大鼠造模前禁食不禁水24 h，编号称重。1.3蜗牛匀浆液制备取活体蜗牛洗净外壳后，禁食不禁水静养12 h排尽粪便。将活体蜗牛去壳后，取 出蜗牛

5、组织，称量，加入适量生理盐水，用手动匀浆仪研磨均匀12，加入不同体 积生理盐水分别稀释成0.2、0.1 g/mL,即得含蜗牛匀浆液的高剂量组与低剂量组 溶液备用。1.4动物模型建立与给药将水合氯醛溶液（5% ）按0.7 mL/100 g腹腔注射给予大鼠，待其麻醉后，经肛 门注入冰乙酸（5%）1 mL，作用30 s后，用0.5 mL生理盐水灌洗1次13。低 剂量组和高剂量组于造模后第2天，按照0.5 g/kg大鼠、1.0 g/kg大鼠分别直肠 给予蜗牛匀浆液，模型组和空白组均给予相应体积生理盐水，1次/d，连续7 d。 1.5大鼠体征的测定每日观察大鼠精神状态、活动情况，记录大鼠造模前和实验结束

6、时的体重，并计算 体重变化。1.6粪便评分参考文献14拟定粪便评分标准，每日记录各组大鼠粪便情况，给出相应评分，按 粪便性状的程度：正常粪便、软粪便、非定型软粪便、水样粪便、血便分别记为0、 1、2、3、4 分。1.7肠重系数测定给药完成后，采用脱颈椎法处死所有大鼠，解剖取出自肛门往上约7 cm肠段，在 生理盐水中清洗，滤纸吸干表面水分后，统一剪取5 cm肠段称重，按照下述公式 计算肠重系数：肠重系数=肠重/体重X100%。1.8结肠组织病理学检测将取出的各组动物肠组织，固定于4%甲醛溶液送检（成都里来生物医学实验中 心）。步骤：依次进行脱水、包埋、切片、染色、封片后，在光镜4x10倍下观 察

7、大体组织、病变，再选择要观察的区域采集400倍图片，观察具体病变15。 对各组结肠的炎症细胞浸润、浸润深度、溃疡深度，按照溃疡性结肠炎症分级评分 标准进行评分。见表1。表1溃疡性结肠炎症分级评分标准病变类型病变程度病变分级炎症细胞浸润无炎症细胞浸润深度溃疡深度轻度中度重度无黏膜层黏膜层和黏膜下层结肠全层无上 皮黏膜固有层黏膜基层0123012301231.9统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用 均数士标准差（）表示，非正态分布资料采用中位数（四分位数间距）M（IQR） 进行描述。计量资料经t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采

8、用LSD-t检验；计数资料和非正态分布资料经秩和检验分析，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验分析，以Pv 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1对大鼠体征及体重的影响模型大鼠经蜗牛匀浆液高、低剂量组直肠给药后，食量、活动开始增加，精神状态 也由萎靡状态逐渐好转。与空白组比较，模型组体重差值降低，差异有高度统计学 意义（Pv 0.01 ）。蜗牛匀浆液直肠给药后，与模型组比较，高、低剂量组大鼠体 重差值均升高，差异有统计学意义（P 0.05）。见表2。表2蜗牛匀浆液对模型大鼠体重的影响（g,）注：与空白组比较，P 0.01； 与模型组比较，*P 0.05 , *P 0.01组别

9、只数造模前给药后差值空白组模 型组低剂量组高剂量组 F 值 P 值 10 10 10 10 187.42.2 189.63.6 189.91.9 189.44.1 218.85.4 208.67.8 215.55.9 220.15.2 31.45.3 19.07.0庭25.66.3*30.74.7*8.755 0.0012.2对大鼠粪便性状的影响冰醋酸造模后大鼠表现出明显腹泻，呈现水样粪便、稀溏或黏液稠密便，甚至血便， 肛周毛发被粪便污染严重。模型组粪便评分高于空白组，差异有高度统计学意义 （P0.01 ）。给药后，高、低剂量组腹泻症状逐渐减轻，由水样型稀便转为松散 型软粪便，从第4天开始，高

10、剂量组的粪便评分低于模型组，差异有统计学意义(PV0.05)。见表 3。表3蜗牛匀浆液对模型大鼠的粪便评分影响分，M(IQR)注：与空白组比较，P 0.01 ;与模型组比较，*P 0.05 , *P 0.01组别只数第1天第2天 第3天第4天第5天第6天空白组模型组低剂量组高剂量组H值P值10 10 1010 0.0 ( 1.0 ) 3.5 ( 1.0 )皿.5 ( 1.0 ) 4.0 ( 1.0 ) 24.807 0.001 0.5 ( 1.0 ) 3.5(1.0 )庭2.0 ( 1.0 ) 3.0 ( 1.0 ) 28.582 0.001 0.0 ( 1.0 ) 3.0 ( 1.0 )庭2

11、.0(0.3 ) 2.0 ( 1.0 ) 26.207 0.001 0.0 ( 1.0 ) 3.0 ( 1.0 )庭2.0( 1.0 ) 1.0 ( 1.0 ) *31.174 0.001 0.0 ( 1.0 ) 3.0 ( 1.0 )庭2.0 ( 1.0 ) 1.0 ( 0.3 ) *28.684 0.001 0.0 ( 0.3 ) 3.0 ( 1.0 )庭1.0 ( 0.3 ) *1.0 ( 1.0 ) *28.891 0.0012.3对大鼠肠重系数的影响与模型组比较，空白组、高剂量组和低剂量组的肠重系数均降低，差异有高度统计 学意义(P0.01)。见表4。表4蜗牛匀浆液对模型大鼠肠重系数

12、的影响注：“-”表示无数据。与模型组比较， *P 0.01组别只数肠重系数(% , images/BZ_18_1428_2553_1478_2587.png )降低百分率(% )空白组模型组 低剂量组高剂量组 F 值 P 值 10 10 10 10 0.1460.039*0.3640.053 0.2510.093*0.1720.081*19.022 0.001 61.3-31.0 52.72.4对大鼠结肠组织炎症的影响用400倍光学显微镜观察，与模型组比较，高、低剂量组的结肠组织黏膜单层柱 状上皮、固有层及黏膜层结构相对清晰和完整，少见变性及坏死，炎症细胞浸润深 度较浅。见图1。另外，采用Kr

13、uskal-Wallis H检验，各组炎症细胞浸润、浸润 深度、溃疡深度评分的分布不同，差异有高度统计学意义(P 0.01)。见表5。 同时，采用Bonferroni法矫正显著性水平后两两比较，模型组在炎症细胞浸润、 浸润深度、溃疡深度评分的分布与空白组比较，差异有高度统计学意义(P 0.01 ）；高剂量组的炎症细胞浸润深度评分与溃疡深度评分的分布与模型组比较， 差异有统计学意义（P 0.05）。见表6。图1各组大鼠结肠黏膜病理组织HE染色（400x） A.模型组：中性粒细胞浸润 （T）； B.空白组；C.低剂量组：中性粒细胞浸润（f）; D.高剂量组表5蜗牛匀浆液对模型大鼠炎症分级评分结果（

14、秩，n=6 ）组别空白组模型组低 剂量组高剂量组H值P值炎症细胞浸润（分级）0 1 2 3均秩6012 0122 0332 0200 5.00 19.08 14.08 11.83 13.639 0.003 炎症细胞浸润深度（分级）0 1 2 3 均秩 6014 0021 0521 0110 6.00 19.33 15.42 9.25 14.973 0.002 溃疡深度（分 级）0 1 2 3 均秩 6015 0031 0100 0520 6.50 20.33 15.33 7.83 18.017 0.001 表6各病变类型炎症评分组间两两比较的结果病变类型t值P值校正后P值炎性 细胞浸润空白组-

15、模型组低剂量组-模型组高剂量组-模型组炎性细胞浸润深度空白 组-模型组低剂量组-模型组高剂量组-模型组溃疡深度空白组-模型组低剂量组-模 型组高剂量组-模型组 14.083 5.000 7.250 0.000 0.197 0.062 0.002 1.000 0.369 13.333 3.917 10.083 0.000 0.302 0.008 0.003 1.000 0.048 13.833 5.000 12.500 0.000 0.183 0.001 0.001 1.000 0.0053讨论现代研究表明中药蜗牛黏液已显示出较好的抗炎、促愈合作用等，如：蜗牛组织匀 浆液中提取的粗蛋白对于多种致

16、病菌和真菌显示出较高的抗微生物活性16;蜗牛 的黏液中存在多种复杂并未充分表征且不能被实验室所合成的活性天然产物17, 在黑色素瘤的体外研究中表现出较好的抗肿瘤活性18;另外在对黏液的粗制纯化 提取物进行哺乳动物成纤维细胞定居的伤口愈合体外实验中，发现其对成纤维细胞 具有促存活、增殖与迁移作用，诱导IL-8的分泌，促进伤口愈合19-20。同时， 研究3 表明溃疡性结肠炎的现代临床治疗采用中药特别是中药直肠给药较西药更 具综合优势。鉴于此，本研究创新性地将蜗牛匀浆液直肠给药治疗UC模型大鼠，通过对其各项 体征的观察及粪便性状、体重、肠重系数、结肠组织炎症等指标的分析，发现蜗牛 匀浆液可以改善模型

17、大鼠活动，使其食量增加、精神状态好转等，并且能够改善大 鼠粪便性状，降低腹泻评分；同时，蜗牛匀浆液可以通过减少结肠炎病理损伤程度 来降低肠重系数和结肠炎症评分，有效控制溃疡恶化累及至结肠黏膜下层，且以高 剂量组作用突出，该研究结果提示，蜗牛匀浆液直肠给药对于UC大鼠确有较好的 保护作用。本实验在蜗牛匀浆液的处理方法中，对鲜蜗牛静养排便、去壳去杂、低温保存、低 温匀浆等环节进行控制，确保受试样品的活性与实验操作的可靠性。尽管结果提示 采用该法制备的蜗牛匀浆液确实显示出良好的抗UC大鼠结直肠炎症损伤作用，但 蜗牛匀浆液同样具备中药组成成分复杂这一共性，其用于抗炎作用的物质基础目前 还不明确，可能的

18、作用机制也不清楚。课题组将在此基础上，进一步对蜗牛匀浆液 进行活性成分研究，以揭示其治疗UC的物质基础与可能机制，以期深入开发挖掘 蜗牛的临床应用价值。参考文献【相关文献】1王丽梅，相祎，吴颖，等.甘露聚糖肽联合美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎的临床效果J.中国医药导 报，2018，15（33）： 89-92.2秦菲，叶柏.中西医结合治疗溃疡性结肠炎的研究进展J.中医药导报，2015，21（14）： 99-101.3胡倩，罗怀岗，李五生.中药灌肠对溃疡性结肠炎的治疗进展J.临床合理用药杂志，2016，94：167-168.4李晓玲.美沙拉秦不同给药途径治疗活动期溃疡性结肠炎的疗效及对血清炎性因子的影响

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