沉淀蛋白质的常用方法

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1、沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）TCA-DOCFor precipitation of very low protein concentration1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (prepa

2、ration of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!).4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). OPTION: Wash pellet twice wit

3、h one volume of cold acetone (acetone keep at -20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed between washes.5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a conseq

4、uence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Normal TCATo eliminate TCA soluble interferences and protein concentration1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final conce

5、ntration. Mix and keep5min -20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the -20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low.(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!).2) Spin 15min 4

6、oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellowcolour as a con

7、sequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acetone PrecipitationTo eliminate acetone soluble interferences and protein concentration1) Add to 1 volume of protein solution 4 volumes of cold acetone. Mix and k

8、eep at least 20min -20oC. (Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low).2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Dry samples under vaccu

9、m (speed-vac)or dry air to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate proteins and removal of Guanidine Hydrochloride beforePAGE-SDS1) Add to 1 volume of protein solution 9 volume

10、s of cold Ethanol 100%. Mix and keep at least -20oC. (Suggestion: leave ON).2) Spin 15min 4oC in microcentrifuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).3) Wash pellet with 90% cold ethan

11、ol (keepat -20oC). Vortex and repellet samples 5min at full speed.4) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air to eliminate any ethanol residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.TCA-DOC/AcetoneUseful method to concentrate proteins and remove ac

12、etone and TCA soluble interferences1. To one volume of protein solution add 2% Na deoxycholate (DOC) to % final (for 100 pl sample, add 1 pl 2% DOC).2. Mix and keep at room temperature for at least 15 min.3. 100% trichloroacetic acid (TCA) to get10% final concentration (preparation of 100% TCA: 454m

13、l H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!).4. Mix and keep at room temperature for at least 1 hour.5. Spin at 4oC for 10 min, remove supernatant and retain the pellet. Dry tube by inversion on tissue paper.6. Add 200 pl of ice cold acetone to TCA pellet.7. Mix and keep on ice for

14、at least 15 min.8. Spin at 4oC for 10 min in microcentrifuge at maximum speed.9. Remove supernatant as before (5), dry air pellet to eliminate any acetone residue (smell tubes). For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer.10. (The presence of some TCA can give ayellow colour

15、 as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)Acidified Acetone/MethanolUseful method to remove acetone and methanol soluble interferences like SDS before IEF1) Prepare acidified acetone: 120mlacetone

16、+ 101 HCl (1mM final concentration).2) Prepare precipitation reagent: Mix equal volumes of acidified acetone and methanol and keep at -20oC.3) To one volume of protein solution add 4 volumes of cold precipitation reagent. Mixand keep ON at -20oC.4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000

17、g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see).5) Dry samples under vaccum (speed-vac) or dry air to eliminate any acetone or methanol residue (smell tubes).TCA-Ethanol PrecipitationUseful method to concentrate protei

18、ns and removal of Guanidine Hydrochloride beforePAGE-SDS1) Dilute 10-251 samples to 1001 withHO2Add 100m of 20% trichloroacetic acid (TCA) and mix (preparation of 100% TCA: 454mlH O/kg TCA. Maintain in dark bottleat careful, use gloves!).2) Leave in ice for 20min. Spin at 4oC for 15 min in microcent

19、rifuge at maximum speed.3) Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue (pellet may be difficult to see).4) Wash pellet with 1001 ice-cold ethanol, dry and resuspend in sample buffer.5) In case there are traces of GuHCl present, samples should be loaded imme

20、diately after boiling for 7 min at 95C6) (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl to obtain the normal blue sample buffer colour.)PAGE prepTM Protein Clean-up andEnrichment Kit - PIERCEThe PAGEp

21、rep Kit enables removal of many chemicals that interfere with SDS-PAGE analysis: guanidine, ammonium sulfate, other common salts, acids and bases, detergents, dyes, DNA, RNA, and lipids.PIERCE: #26800 - PAGE prepTM ProteinClean-up and Enrichment Kit (pdf)Chloroform Methanol Precipitation Useful meth

22、od for Removal of salt and detergents1) To sample of starting volume 100 ul2) Add 400 ul methanol3) Vortex well4) Add 100 ul chloroform5) Vortex6) Add 300 ul H2O7) Vortex8) Spin 1 minute 14,0000 g9) Remove top aqueous layer (protein is between layers)10) Add 400 ul methanol11) Vortex12) Spin 2 minut

23、es 14,000 g13) Remove as much MeOH as possible without disturbing pellet14) Speed-Vac to dryness15) Bring up in 2X sample buffer for PAGEReference: Wessel, D. and Flugge, U. I. Anal.Biochem. (1984) 138, 141-143徐炉李 2011-05-28 14:35楼主蛋白质浓缩方法很全 - 丁香园论坛-医学/药学/生命科学论坛蛋白质浓缩方法总结一个简便的方法你可以试试：找一透析袋，底部扎紧，袋口扎一去

24、底的塑料或玻璃试管，将 待浓缩的液体从管口灌入透析袋中，将整个装置挂在冰箱中，或者用电风扇吹，液体干后可 再继续加入，直至样品浓缩至所需体积。如必要，可事先将待浓缩液用蒸馏水或去离子水透 析以去盐分，然后再按上述方法浓缩，这样可以避免浓缩后盐份过高。此法简便易行，我们 实验室常用此法浓缩。浓缩后的液体可以用吸管从试管口吸出，而且透析袋只要不破裂，可 以反复使用。可以用 millipore 公司的 amicon ultra 15 cenfilter unitetrifugal units。每个 30 多元，但是效果非常好。只需要将培养上清加入，然后高速离心后即可直接得到无菌的浓缩液。对于新的透析

25、袋有化学杂质，需要处理，为了去除这些杂质，通常我们用10mmol/L的碳酸氢钠，1mmol/L的EDTA溶液煮沸30min，之后用双蒸水充分冲洗，之后放在EDTA溶液4 度保存！防止微生物污染！冷冻干燥或peg20000都可以此种方法就是超滤浓缩，使用方式有的是离心，有的是加压，有的二者皆用。除了 amicon 之外，我知道赛多利斯也是很有名的供应厂家，就是做天平很出名的那家德国公司。超滤浓 缩这种方式的确太方便了，而且除了有浓缩作用外，还有脱盐功能，速度又快，比传统的透 析好多了，实验室用和生产用型号都能找到。不过据介绍，不能反复用！而且价格大家也知 道了， 30元左右，一般一个包装25个，

26、 100个，单个还不知道卖不卖。根据中国国情，呵 呵，我建议没经费的实验室还是不要考虑啦；如果时间不紧张，不怕花几天时间，用25元/ 米的透析袋一样可以达到效果。冷冻干燥的体积当然越小越好了，如果你的蛋白很稳定那-70度应该没有什么问题的，我觉 得冷冻干燥时间长，如果量不大直接用沉淀的方法浓缩就可以了。浓缩的目的是使体积小这 样快，而体积很大的话冷冻干燥慢，如果你的冷冻干燥机的真空、泵很好，那么体积大也没 有关系，但是要保证你的液体的高度别超过2cm那其实也是很快的，所以关键看你样品的 体积和你机器的好坏了。可以试一下下面这个简单的办法：直接向要浓缩的蛋白质样品中加入sephadex G25干

27、粉，待干粉吸水后离心取上清即可，这样离子强度保持不变，又达到了浓缩的目的我是用双蒸水进行除盐的，就是在刚开始的时候要多换几次双蒸水，一般24 小时就可以了。 楼上占战友们所说的 millipore 的超滤离心管我本来想买的，但考虑到价格的问题就放弃了。 将样品放在透析袋中，注意留出一半的容积，（以免水将透析袋涨破）24 小时后将透析袋 放入 20%的分子量为10000 的聚乙二醇中，一般几个小时就可以了。我买的是进口分装的 PEG,感觉不错。希望能对你有所帮助。三氯乙酸沉淀可能会使蛋白变性的，那么再用PBS或别的缓冲液都难溶解，所以我觉得如果 要想保持蛋白的活性还是别用这样的方法。电泳样品当然

28、可以，但是要注意你的样品用缓冲 液难溶解，可以直接加电泳上样缓冲液就可以了，没有必要再用PBS溶解。三氯乙酸沉淀后，样品要用丙酮洗，然后要吹干，然后可以重新溶解般可以将样品放入透析袋，再将周围撒多点PEG20000，半天能够浓缩10倍以上如果打算用PEG的话，要选择好PEG的型号，某型号透析袋透过分子量的大小，还好考虑 你的目的蛋白分子量的大小。我用过PEG2000，回收很方便。它的熔点很低，大约只有50 度。就现在的天气，把它平铺在磁盘里，自然干燥就行了。不建议大家选用太小分子量的 Peg， 要根据透析带来选择， 我一般是选用透析膜能通过分 子量的两倍以上的Peg，如果大家只用来做Weste

29、rn ，用蔗糖就行了。1）我们在做sds-page的时候 样品的浓缩是用1M的三氯乙酸 离心以后再加丙酮进行清洗 把三氯乙酸除去，如果三氯乙酸没有除干净的话，样品加了LOADING BUFFER以后会变成黄 色，不知道你有没有出现这种现象个人认为秀芬兰旁边的黑糊糊的一团东西可能是样品中的 一些小分子的物质。2）有的样品处理过程一样，但宽窄不一，原因可能是样品中的盐浓度不一致，盐浓度过高 会显着影响蛋白质的电泳，使蛋白质条带明显变宽，有时还会成微笑状。我的经验与老兄不同:1. 胶中蛋白条带宽窄不一原因是:因为蛋白结合电荷量不同!即所加样品中蛋白含量不同!2. 盐浓度过高不会显着影响蛋白质的电泳.

30、我用硫酸铵分级沉淀时蛋白未透析.sds-page蛋白 条带没有变化!你可做个对照看一下!取待浓缩样品1mL，加入100 uL三氯醋酸，振荡混匀后于4oC静置30后离心（10000X10 min）, 去除上清,沉淀中加入 1mL acetone（-20oC 预冷） ，剧烈振荡混匀后. 10000rpm X5 min, 此步可以重复一次以保证三氯醋酸可以完全除去，最后将管子在室温放置30分钟干燥后溶 解于缓冲液中电泳分析。如果不是预冷的丙酮，可以在低温冰箱中静置10 分钟即可。看到大家在论坛上经常讨论这个问题，我也凑凑热闹！关于TCA沉淀蛋白作为SDSPAGE上样的准备在本论坛的贴子很多，各种各样

31、的protocols 都有，不过总结来说都是含两个方面，一是TCA沉淀，二是用丙酮洗去残留的TCA！也许是 大家做上游做的多了，对于这个不太熟悉；也许是大家提供的方案太多，仔细看都不太相同， 乱了思绪，我也提提我的看法，希望能理清思绪！TCA沉淀蛋白的方法据我所知，最早是lowry于1951年发表在JBC上的一篇题为PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT”上用过的，当然这篇文章也就是着名的 lowry法定量蛋白的提出篇！随后在很多文献，包括现今新的处理蛋白的文献中也有采用， 可见这个方法如何的被青睐！ 具体操作方面，不管你用什么4：

32、1的体积比也好，还是摩尔浓度(1M TCA)也好，一般TCA 的终浓度在5%10%(W/V)都可以！我从书上节选了这么样的一段英文 大家可以看看： We routinely precipitate samples with trichloroacetic acid (TCA) before SDS-PAGE.This concentrates the samples, eliminates a great deal of buffer variability, and denatures proteinases and substrates in a rapid step that does

33、not allow time for extensive artifactual proteolysis. Typically, a final concentration of TCA of 5% (w/v) at 4C for 10 min will be adequate. The precipitated proteins are recovered by brief centrifugation (10,000g for 1 min, in a benchtop microcentrifuge),and the TCA is poured away. Residual TCA, wh

34、ich would otherwise change the pH of the sample buffer, is removed by repeated gentle washing with acetone or diethyl ether,and after three washes, the protein pellet is redissolved in SDS-PAGE sample buffer.下面的两篇文献可供参考：1. Polacheck and E. Cabib, Anal. Biochem. 117, 311 (1981).2. ENRICO CABIB and IT

35、ZHACK POLACHECK,methods in enzymology 104卷，415416丙酮干燥时间一定不能太长，否则pellet很难溶的，这是我的经验我看最简单的是将低浓度蛋白装入合适透析袋用PEG6000-8000包埋，每10min换一次 PEG6000-8000，浓缩至微量体积后再用合适缓冲液透析有可能进入的微量小分子PEG，速度 很快，我用它作过病毒的浓缩丙酮沉淀都说会丢失蛋白质，可是还有这么多人用沉淀法！1、到底会丢失多少蛋白质2、为什么会丢失3、尿素和其他裂解液的成分溶于丙酮吗如果跟着沉淀下来，会不会影响上样液中各种成分 的浓度，进而影响聚焦4、丙酮风干不充分，会影响 I

36、EF 聚焦吗5、一般你们沉淀多久最少多久6、丙酮沉淀真的可以去除离子吗我的标本同样沉淀，为什么有时电压上不去有时上的去1,肯定会丢失蛋白质,具体丢多少取决于样品的种类.2,有些蛋白质一经沉淀之后难以再溶解.3, 应该不会跟着沉淀下来,至少绝大部分不会.4,一般 5 分钟风干足够了,尽量充分.5,最少2 小时以上以沉淀完全,减少丢失的蛋白质。偶常用沉淀过夜。6,可去除大部分离子，但还有一小部分会跟着沉淀。丙酮中可以加DTT，也可以不加。建议还是加,对溶解性有好处.-20 度沉淀过夜没问题.我用丙酮沉淀发酵液的蛋白质，发酵液含有磷酸盐缓存液，用丙酮沉淀后盐含量很高。我做 了一个对照试验，将丙酮直接

37、加在一定浓度磷酸盐缓存液中，明显看到白色的沉淀，我感觉 丙酮的去盐不好。谢谢你，我也是因为有些怀疑这个才发帖子的。你都用盐溶液试过了，事实胜于雄辩，看来 去盐最多只是一部分。根据你的提示，回头我试试向裂解液中加丙酮，看看尿素等会不会沉淀下来。 另外，丙酮不是夺取水分，蛋白才会沉淀下来吗所以溶于水的成分必然会沉淀下来。这是我 的理论上的推测。（供大家讨论丙酮沉淀的原理） 另外我还觉得，如果裂解液的成分跟着沉淀下来，会影响上样液中各种成分的浓度，进而影 响聚焦。所以我觉得沉淀应该考虑裂解液的成分和浓度。（个人观点，供大家讨论） 建议主任给上面观点的朋友加分。有盐的样品其实用丙酮淀肯定盐也会沉淀下来

38、的，这取决于盐的浓度和蛋白的浓度，理论上 蛋白的浓度越高，沉淀损失也越少，而且沉淀的时候最好在低温进行，可以避免蛋白的沉淀， 沉淀后也尽快去除丙酮，这样也可以避免蛋白的变性。其实同样条件下也可以用乙醇沉淀， 乙醇极性大点，这样可以盐的溶解度也大点，其实不同蛋白其实溶解也不同，例如脂溶性蛋 白在有机溶剂中倒溶解得更好，我觉得要想做好电泳，那还是透析或者凝胶过滤除盐后再浓 缩，这样保险点。的样品+ 1M 三氯乙酸， 4 摄氏度放置10-20分钟，如果效果明显，可以看到絮状沉淀，然后 离心，5000rpm, 5-10min,时间具体自己掌握，只要沉淀离心下来就好，加1ml丙酮清洗 沉淀，除去多余的三

39、氯乙酸，然后干燥，如果觉得沉淀的蛋白不够，可以在加丙酮之前，重 复三氯乙酸沉淀步骤。电吹风不需要太长时间，你可以看到沉淀蛋白的颜色变化，其变成粉末状就可以了 我不是老手，但是作拉四年这方面的实验我经常用丙酮沉淀一些sample，方法非常可靠，且 简单易用，我看到这方面的书，是国外版的，方法可能大家都知道，但是我想应该注意几个 问题：1，沉淀的时间一般以4 个小时以上为好，过夜就更没问题，但是一定要放到冰箱的冷冻室。（着急的话1 个小时就可以拉我试过，中间震荡几次）2，在放置期间要震动混合数次为好。3，一万转离心5 分钟，在恒冷离心机，保持蛋白或酶的活性。4，去上清后，要真空离心10-15分钟（

40、我看有的人说放置5 分钟我看不大可行，如果丙酮 残留的话，那没办法点泳，标本沉不下来）。5，丙酮对sample的比例是4： 1我想大家都知道，这些仅供参考。具体有多少蛋白损失， 我不太清楚，但是我想除非你的sample非常少，否则多加一点就是拉，有时候纯化过量， 还得用水去稀释再用于试验。丙酮沉淀蛋白的机理是：根据库伦定律，溶液介电常数的下降（丙酮25 摄氏度时介电常数 为21，水为81），造成静电作用力的增强，同时，丙酮与蛋白对水的争夺直接导致水化层 的破坏，从而造成蛋白沉降。丙酮造成蛋白变性的原因：常温或升温时，蛋白立体结构展开， 丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结合导致蛋

41、白变性，所以我们通常预 冷丙酮并且低温操作。低浓度的盐不会沉淀，但是通常盐浓度高于时，因为介电常数的降低 导致盐的溶解度也下降而析出。初始蛋白浓度不易过高，很容易造成共沉淀。我觉得用丙酮比用TCA要好TCA酸度太高，离心弃上清以后管壁上面还是有很多酸。加了 上样缓冲液以后，很快就变黄了。不得不加的NaOH中和，至少要加几十uL,这样一来样 品酸度是降下来了，但是样品的浓度却减低了。不利于点样。Amersham 好像推荐用以下的冬冬 溶解样品。 “ 7MUrea, 2MThiourea, 4%（w/v） CHAPS, 40nMTris-base, 40nM DTT, 2% Pharmalyte Ph 3-10”是配方顶帖0 回复0