科学故事.蛋白质化学

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1、第一章氨基酸科学故事:第二十二种原则氨基酸生物学家因发现新的氨基酸带来的喜悦不亚于物理学家发现了新的粒子或化学家发现了新的元素。196年此前，人们始终觉得,出目前蛋白质分子中的由遗传密码编码的原则氨基酸残基只有2种。到了1986年,科学家们终于在含硒蛋白中发现第二十一种原则氨基酸含硒半胱氨酸。时隔之后，来自美国俄亥俄州立大学的两个研究小组在产甲烷细菌里发现了第二十二种原则氨基酸吡咯赖氨酸。俄亥俄州立大学由Joeph .Krzi领导的研究小组始终在研究一种属于古细菌的产甲烷微生物巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina bakeri）。此微生物可以将单甲胺(monomethylmie)、二

2、甲胺（dimetylme）和三甲胺（trmethylamine)转变成甲烷。199年，Krzcki的研究小组分离得到某些与甲烷生成有关的特殊蛋白质。两年后来，她们分离得到编码其中一种蛋白质的基因,并测定出了它的核苷酸序列。1998年,她们刊登了这个基因的全序列，成果显示其阅读框架内具有一种反常的琥珀型终结密码子(arcoon）。密码子是决定氨基酸的三字母核苷酸序列(参看“第三十八章蛋白质的生物合成与细胞内降解”),琥珀型终结密码子的核苷酸序列是TG,它一般不决定任何氨基酸，它的浮现一般是多肽链合成结束的标志。然而，让rzyki吃惊的是 ，该终结密码子居然编码一种氨基酸，并且这种奇怪的现象还出目

3、前其她几种与甲烷产生有关的基因上。与此同步，由Michael Chan领导的研究小组开始研究由琥珀密码子编码的氨基酸的构造。她们意识到这个古怪的密码子也许编码一种新的氨基酸,但也有其她的也许性。Krzyci及其同事决定测定本来蛋白质的氨基酸序列。当得到蛋白质的氨基酸序列后来,她们发现由琥珀密码子决定的氨基酸似乎仅仅是一种赖氨酸。但是,Krzycki仍然规定Chan和她的一种博士研究生inHao对具有这个氨基酸的蛋白质晶体构造进行研究以拟定那个氨基酸的性质。通过两年的研究，a和Hao终于拟定了这个蛋白质的构造。她们得到的某些数据表白那个氨基酸是一种新的氨基酸。不仅如此，Krycki还在寻找其她证

4、据。她和她的博士研究生ayathri rnivaan、CaryJames不久发现了一种新的特异性NA专门负责将新的氨基酸插入到蛋白质之中,同步还发现其她某些与此过程有关系的酶。综合以上两个发现以及更为具体的晶体构造，她们确信她们发现了第二十二种由DNA编码的氨基酸吡咯赖氨酸。她们还觉得,这个新的氨基酸是一种非常罕见的氨基酸,因此这样近年后才被发现。然而,Kryck相信它也也许存在于其她有机体内。对此Cn表达批准并指出,发现第二十二种氨基酸将鼓励更多的研究者去寻找第二十三种乃至第二十四种氨基酸。随着更多种生物的基因组序列被破译，有理由觉得某些有趣的事情迟早会发生。 小结氨基酸是一类同步具有氨基和

5、羧基的有机小分子。构成多肽和蛋白质的氨基酸除Gy外，都属于L型的- 氨基酸（Pro为亚氨基酸)。氨基酸不仅可以作为寡肽、多肽和蛋白质的构成单位或生物活性物质的前体，也可以作为神经递质或糖异生的前体,还能氧化分解产生ATP。目前已发现蛋白质氨基酸有22种，其中20种最为常用,而硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸比较罕见。非蛋白质氨基酸一般以游离的形式存在,作为代谢的中间物和某些物质的前体,具有特殊的生理功能。2种原则氨基酸可使用三字母或单字母缩写来表达。某些原则氨基酸在细胞内会经历某些特殊的修饰成为非原则蛋白质氨基酸。氨基酸有多种不同的分类措施：根据R基团的化学构造和在pH7时的带电状况,可分为脂肪族氨基酸

6、、不带电荷的极性氨基酸、芳香族氨基酸、带正电荷的极性氨基酸和带负电荷的极性氨基酸;根据R基团对水分子的亲和性,可分为亲水氨基酸和疏水氨基酸;根据对动物的营养价值,可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。氨基酸的性质由其构造决定。其共性有：缩合反映、手性（l除外)、两性解离、具有等电点,以及氨基酸氨基和羧基参与的化学反映,涉及与亚硝酸的反映、与甲醛的反映、Snger反映、与异硫氰酸苯酯的反映和与茚三酮的反映等。与亚硝酸的反映可用于an Slyk定氮,与甲醛的反映可用于甲醛滴定,Sager反映和与异硫氰酸苯酯的反映可用来测定N-端氨基酸。只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反映产生黄色物质,其他生成蓝紫色物质,运

7、用此反映可对氨基酸进行定性或定量分析。多数氨基酸的侧链也许发生特殊的反映,可以此鉴定氨基酸。不同氨基酸在物理、化学性质上的差别可用来分离氨基酸,其中最常用的措施是电泳和层析。第二章 蛋白质的构造科学故事:一级构造决定高档构造蛋白质的高档构造由其一级构造决定的学说最初由Chritan B. nfinsen于1954年提出。在1950年之前，Ansn始终从事蛋白质构造方面的研究。在进入美国国立卫生研究所(IH)后来,继续从事这方面的研究。当时她最想懂得的是：一种蛋白质是如何折叠成它独特的三维构象的？需不需要其她酶的协助?蛋白质为什么要采用特定的构象?histiaBnse然而,要想理解蛋白质的折叠过

8、程,一方面需要建立一种措施可以测量或评估蛋白质的构象,另一方面还需要找到一种手段用以检测折叠过程。Anisen以牛胰核糖核酸酶(ribouclee）为研究对象轻而易举地解决了第一种问题（事实上选用此酶的部分因素是当时的芝加哥肉类加工公司可觉得她的实验室随时提供足够的原材料),由于核糖核酸酶催化RNA的水解,其酶活性完全取决于其特定的三维构象,于是酶活性成为测量这种蛋白质采用何种构象的一种措施。但要观测折叠过程既可以从一种新合成的尚没有折叠的蛋白质开始,也可以在体外将一种已折叠好的蛋白质去折叠(unold)，然后再观测它的再折叠(ref）过程。nfie选择了后一种途径。事实上,这种酶特别适合用后

9、一种途径进行研究,一方面由于二硫键是决定其分子形状的重要因素。此外,此酶是一种单纯蛋白质,只有124个氨基酸残基构成,具有4个二硫键,并且其活性很容易通过测定水解NA释放出来的核苷酸量来测定。ninn和两个博士后Mhel Sea、 Fred White在研究中发现,使用高浓度的巯基试剂巯基乙醇(- meraoethanol)可将二硫键还原成自由的巯基,如果再加入尿素，进一步破坏已被还原的核糖核酸酶分子内部的次级键，则该酶将去折叠转变成无任何活性的无规卷曲。对还原的核糖核酸酶的物理性质进行分析的成果清晰地表白了它的确采用的是无规卷曲的形状。在成功得到一种去折叠的核糖核酸酶后来，Anfnn 着手开

10、始研究它的重折叠过程了。考虑到被还原的核糖核酸酶要在已被还原的8个Cs残基上重建4对二硫键共有105 种不同的组合,但只有一种是对的的形式，如果决定蛋白质构象的信息始终存在于氨基酸序列之中，那么,最后重折叠得到的总是那种对的的形式。否则，重折叠将是随机的，最后只能得到少量的对的形式。显然,第一种情形能完全恢复去折叠过程中丧生的酶活性,而后一种状况只能恢复很少的酶活性。 fisn的重折叠实验还是比较顺利的,她通过透析的措施除去了导致酶去折叠的尿素和巯基乙醇，再将没有活性的酶转移到其生理缓冲溶液之中,在有氧气的状况下于室温放置,以使巯基能重新氧化成二硫键。通过一段时间后来，发现核糖核酸酶活性得以恢

11、复，这意味着它本来的构象恢复了(图2-47)。由于上述过程没有细胞内任何其她成分的参与,完全是一种自发的过程，因此,有理由相信此蛋白质对的折叠所需要的所有信息所有存在于它的一级构造之中。不久，Anfnsn的研究成果被刊登在1954年 生物化学杂志(ornl of ilogicaChemistry,JB)上。进一步的实验拟定了变性的核糖核酸酶完全恢复其活性的条件,在此基本上，Anfinsen提出了蛋白质折叠的热力学假说(terdynmic htesi）。根据此假说，一种蛋白质的天然三维构象相应于在生理条件下其所处的热力学最稳定的状态。热力学稳定性由构成的氨基酸残基之间的互相作用决定，于是蛋白质的

12、三维构象直接由它的一级构造决定。图2-4 牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验尽管Anfnen的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基本，她也因此获得了9年的诺贝尔化学奖，但是蛋白质折叠是相称复杂的。到目前为止,我们仍然不能根据一种蛋白质的一级构造推断出它的三维构造。同步，还必须注意到,蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要慢得多!肽是氨基酸之间以肽键相连的聚合物,它涉及寡肽、多肽和蛋白质。氨基酸是构成肽的基本单位。线形肽链都具有端和C端,书写一条肽链的序列总是从N端到端。肽键具有部分双键的性质,多为反式,也有顺式。酰胺平面中CN单键旋转的角度称为，CC单键旋转的角度称为。和决定了相邻两个肽单位在空间上的相对

13、位置。21个氨基酸残基构成的肽为寡肽,12个氨基酸残基构成的肽为多肽，由5个以上的氨基酸残基构成的肽一般被称为蛋白质。天然存在的活性肽有的是在核糖体上合成,有的在核糖体以外的地方由特定的酶依次催化而成。寡肽的理化性质涉及两性解离、双缩脲反映等。蛋白质的构造一般涉及一级构造、二级构造、三级构造和四级构造，二级构造、三级构造和四级构造被称为高档构造，一种蛋白质的所有三维构造一般被称为它的构象。蛋白质的一级构造是指氨基酸在多肽链上的排列顺序,含二硫键的蛋白质的一级构造还涉及二硫键的数目和位置。蛋白质的二级构造是指多肽链的主链骨架自身在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定

14、的。常用的二级构造有螺旋、三股螺旋、折叠、转角、凸起和无规卷曲。螺旋中肽链骨架环绕一种轴以螺旋的方式伸展，它也许是极性的、疏水的或两亲的。折叠是肽链的一种相称伸展的构造,有平行和反平行两种。如果股交替浮现极性残基和非极性残基,那么就可以形成两亲的折叠。转角指伸展的肽链形成180的U形回折构造而变化了肽链的方向。凸起是由于折叠股中额外插入一种氨基酸残基而形成的，它也能变化多肽链的走向。无规卷曲是在蛋白质分子中的某些极不规则的二级构造的总称。无规卷曲无固定走向，有时以环的形式存在,但不是任意变动的。从构造的稳定性上看,右手螺旋折叠 U型回折无规卷曲，但在功能上,酶与蛋白质的活性中心一般由无规卷曲充

15、当，右手螺旋和折叠一般只起支持作用。蛋白质的三级构造是指多肽链在二级构造的基本上,进一步盘绕、卷曲和折叠，形成重要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维构造。三级构造一般由模体和构造域构成。稳定三级构造的化学键涉及氢键、疏水键、离子键、范德华力、金属配位键和二硫键。模体可用在一级构造上,特指具有特殊生化功能的序列模体，也可被用于功能模体或构造模体，相称于超二级构造。构造模体是构造域的组分,基本形式有、和等。常用的模体涉及：左手超螺旋、右手超螺旋、卷曲螺旋、螺旋束、 螺旋环- 螺旋、Rosmn卷曲和希腊钥匙模体。构造域是在一种蛋白质分子内的相对独立的球状构造和/或功能模块，由若干个构造

16、模体构成的相对独立的球形构造单位，它们一般是独自折叠形成的，与蛋白质的功能直接有关。一种构造域一般由一段持续的氨基酸序列构成。根据其占优势的二级构造元件的类型，构造域可分为五大类：构造域、构造域、/构造域、+构造域、交联构造域。以上每一类构造域的二级构造元件也许有不同的组织方式,每一种组织就是一种构造模体。这些构造域均有疏水的核心，疏水核心是构造域稳定所必需的。拟定一种蛋白质的三级构造的措施有X射线晶体衍射和NM。可以用不同的模型来展示蛋白质的三维构造,常用的模型有:线框模型、球棍模型、棍式模型、空间填充模型、骨架模型和丝带模型。具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级构造。

17、构成寡聚蛋白质或多聚蛋白质的每一种亚基均有自己的三级构造。蛋白质的四级构造内容涉及亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的互相作用。驱动四级构造形成或稳定四级构造的作用力涉及氢键、疏水键、范德华力和离子键。具有四级构造的蛋白质具有特殊的优势，不合适的四级构造的互相作用会影响到某些蛋白质的功能。蛋白质是高度柔性的分子，其柔性是生物功能所必需的。三级构造的柔性容许蛋白质适应它们的配体。蛋白质柔性随着功能的不同而不同，并不是所有的蛋白质的柔性都同样。蛋白质折叠的基本规律涉及:一级构造决定高档构造；蛋白质的折叠随着着自由能的减少，但是并不通过随机尝试找到自由能最低的构象；是协同和有序的过程;绝大多数需

18、要分子伴侣的协助。某些蛋白质的折叠还需要蛋白质二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶的协助。蛋白质折叠通过启动过程形成构造域，再经熔球态中间体最后形成完整的三维构造。蛋白质在溶液中折叠的驱动力有：肽链内的氢键释放水，增长水的熵；疏水侧链倾向聚合以尽量减少与水接触的疏水面积;亲水残基面向表面与水接触,增长溶解性。细胞内错误折叠的蛋白质来不及解决就也许导致机体的病变。与蛋白质错误折叠有关的疾病有阿尔茨海默病、帕金森病和牛海绵状脑病等。蛋白质高档构造可以通过预测来进行研究。与预测蛋白质的三级构造相比，二级构造的预测要容易某些,由于20多种原则氨基酸残基具有形成不同二级构造的倾向。对于两种重要的二级构造而言，

19、 螺旋可被视为多肽链的默认二级构造状态，由于 螺旋与折叠相比具有熵的优势。目前使用从头计算法预测三维构造还很不成功。获得一种蛋白质精确的三级构造仍然需要借助于X射线衍射和NMR。可以对蛋白质单独进行功能预测或者与构造预测结合起来。第三章 蛋白质构造与功能的关系科学故事:一种多功能蛋白质的发现此前分子生物学里有一种基本观点,就是一种基因决定一条多肽链，而一条多肽链只具有一种特殊的功能。但随着分子克隆技术的发展，越来越多已知活性的蛋白质及其基因被克隆、测序和比对后来发现，蛋白构造与活性之间不再是个单纯的一对一的关系了。187年，芬兰uu大学的Pilajanei在研究人体胶原蛋白的时候就发现了这样的

20、例外。anaihlajaim胶原蛋白是人体中含量最多的蛋白质,其二级构造是由三条相似的多肽链互相缠绕而成的三股螺旋,每条肽链上具有多种GlyY反复序列，其中X位置重要是Pro,Y位置重要是羟脯氨酸（yp)。胶原蛋白三股螺旋构造的稳定性与Y位置上脯氨酸有多少被羟基化有关，因此,催化Pro羟基化的脯氨酸羟化酶（rol-4-roxylase)是决定胶原蛋白稳定性的一种十分重要的酶。脊椎动物的这个酶是由2个基和2个亚基构成的四聚体。亚基和 亚基分别由不同的基因编码。不管 或 亚基,单独都没有活性，但 亚基的单克隆抗体能使整个酶失去活性,而只有 和 亚基同步存在的时候，酶才干与它的辅助因子抗坏血酸结合,

21、这阐明 亚基的确是体现酶活性的重要构成部分。但奇怪的是, 及 亚基在细胞内的体现并不一致。 亚基的数量远远高于 亚基,因此 亚基合成后立即会与 亚基结合成有活性的脯氨酸羟化酶，而留下许多单独存在的 亚基。那么单独的 亚基会有其她的功能吗?既然蛋白质的一级构造决定蛋白质的高档构造，而蛋白质的高档构造又决定它的功能,那么如果懂得了一种蛋白质的一级构造,不仅可以预测和解释这个蛋白质的高档构造和功能,同步还可以将这个蛋白与其她已知功能的蛋白质进行序列比对，从而有也许发现新的功能。ihajanemi在得到脯氨酸羟化酶亚基的一级构造后来,也将它的氨基酸序列输入计算机，在互联网上和其她已知的蛋白质的氨基酸序

22、列进行比对。出乎意料的是，她发现人类脯氨酸羟化酶亚基中94%的氨基酸与小鼠的蛋白质二硫键异构酶(proeindili somerse,PDI）相似。她用纯化的亚基也检测到它的确有PD的酶活性，再用克隆的亚基的cDNA作探针，发现人类细胞中只有一种基因具有类似的碱基序列。因此PDI很也许就是单独的脯氨酸羟化酶的亚基。换句话说,一种基因体现出来的蛋白质在不同的条件下可以同步具有两种完全不同的酶活性。I早在19年就在鼠肝和胰腺组织中被发现,其重要功能是催化蛋白质上二硫键的互换反映，具有较广的底物特异性。PI在体外可以增进被变性和还原的具有二硫键的蛋白质(如胰岛素、溶菌酶、核黄素结合蛋白和抗体等)重获

23、活性。当一种蛋白质的天然构象遭尿素破坏，而其二硫键也被还原剂打破后来，若要恢复这个蛋白质本来对的的构象,不仅要除去尿素,同步还要让二硫键重新形成，并恢复到本来对的的连接，D就可以加速这个“尝试错误、发现对的”的过程。但PDI在人体内与否也扮演同样的角色则仍是未知数。有了这个后知之明，再去看DI在体内分布的情形,发现PI的活性重要集中在内质网,这很容易让人们想起它也许在分泌蛋白折叠过程中起作用，由于许多分泌蛋白都具有二硫键。而后来的许多研究证明,PDI的确就具有这种功能。那么,亚基的功能是不是就到此为止了呢?99年， R Wetteran 等使用氨基酸序列分析和免疫化学分析发现一种由大小两个亚基

24、构成的微粒体三酰甘油转移蛋白（microsoaltglyceide ranfe proten,T）的小亚基与脯氨酸羟化酶的亚基一模同样。但MT的PI酶活性仅是自由PDI的十分之一。后来又有人发现，单独的亚基在细胞内还充当甲状腺素结合蛋白（rd hormoebinding otei,TP）。迄今为止，已经发现了许多多功能蛋白，像哺乳动物的脂肪酸合酶居然具有7种酶活性外加一种酰基载体蛋白的功能。多功能蛋白质的存在不仅可以提高基因的编码功能,并且还也许有助于对蛋白质的活性进行调控。小结蛋白质可视为生物功能试剂，几乎每一项细胞活动都牵涉到一种或多种特定的蛋白质。蛋白质的重要功能涉及分子辨认、酶、分子开

25、关和构造支持。分子辨认是蛋白质功能的中心。配体与蛋白质的特异性结合受到形状、互补性和极性互相作用的控制。蛋白质表面大分子配体的结合位点也许是凹陷、突起或“平地”;小分子配体的结合位点是裂缝、口袋或空穴。蛋白质和配体结合的亲和力重要归于无方向性的疏水作用，结合的特异性重要归于具有方向性的力，如氢键。蛋白质的功能由其特定的三维构造决定。每一种蛋白质都具有特定的构造和特定的功能,高档构造决定其功能。蛋白质的一级构造决定其高档构造和功能,一级构造相似的蛋白质具有相似的功能。功能相似的蛋白往往在进化上具亲缘关系,一级构造相似的蛋白质往往具有共同的来源。许多疾病是由有关的蛋白质构造异常引起的。纤维状蛋白质

26、由几条肽链铰合而成,难溶于水，它们倾向于形成规则的长的曲线构造,这是由其一级构造的高度规律性决定的。它们的重要功能是在构造或机械上,为生物体提供坚实的支架。-角蛋白来源于动物的毛发、角、鸟喙和爪子。每一种-角蛋白分子在其中央形成典型的螺旋,而两端为非螺旋区。两个角蛋白分子通过疏水的R基团的结合,互相缠绕形成双股的卷曲螺旋，这大大地提高了 螺旋的稳定性。链间形成的多种二硫键还可进一步提高-角蛋白的强度。角蛋白重要来源于蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白，其一级构造具有反复序列GlyAlSeGlya/Se;二级构造重要是反平行折叠。Gly和l/Ser分别分布于折叠片层的两侧，使得相邻的折叠更快密地堆积形成网

27、状构造,赋予蛛丝较高的抗张强度,同步 螺旋又赋予蛛丝一定的柔软性。相邻的角蛋白之间无共价交联。胶原蛋白是动物细胞外基质的一种成分,其基本构成单位是由3条链构成的原胶原分子。原胶原的一级构造具有反复的GlX三联体序列。X和Y一般是Pro。胶原蛋白富含Gy和Pro的性质使得它难以形成螺旋,但有规律反复的三联体序列增进三条胶原蛋白链之间形成三股螺旋。球状蛋白质的构造与功能要比纤维状蛋白复杂。属于球状蛋白的珠蛋白家族都具有血红素辅基,都可以可逆地结合氧气，都具有珠蛋白折叠这样的构造模体。属于这一类家族的有Mb、Hb、N和Cygb。Mb存在于肌肉中，其功能重要是贮存和运送2,此外还能解除N的毒性。Mb的

28、分子表面形成一种深的疏水口袋,血红素 “藏”在洞中。该口袋容许进入而制止H2O的进入，既保证了e2+结合O2又可避免F2+的氧化。Mb的氧合曲线是双曲线，这使得它倾向于结合O2而非释放O2，只有在pO2极低的时候才释放出O。Hb存在于红细胞，其功能是运送氧气。Hb由四个亚基构成，每个亚基的一、二和三级构造与M相似。Hb氧合曲线由于它与2结合具有正协同效应而呈S形，只有在pO很高的状况下b才结合氧气，而pO2一旦减少,它就释放。b的正协同效应是指Hb分子中一种亚基结合2后，可以导致其构象发生变化,使其她亚基对的亲和力忽然增强。可使用il系数对b的正协同效应进行评估：n =1，无协同效应；n 1，

29、为正协同效应 ；n 1,为负协同效应。H+、CO2和2,3-BP等小分子配体对的氧合也产生影响。其中H+和C2增进b释放O，这样的效应被称为波尔效应。,3BPG可与脱氧b上的位于两条亚基之间的带正电荷的空洞结合，稳定T态,明显减少Hb与O2的亲和力,增进Hb在组织中释放O2。H是Hb的突变体,它直接导致镰状细胞贫血。HbS导致溶血的因素在于其亚基的Glu6突变成Val6后来，HbS由于疏水键而汇集在红细胞表面使细胞膜破裂。Ngb和Cygb是近期发现的珠蛋白,g重要在脊椎动物的大脑和视网膜细胞中体现,Cygb几乎在脊椎动物所有的细胞和组织中都能体现。与Mb和Hb不同的是,b和Cyb的血红素辅基上

30、的铁在没有氧气结合的时候,已有个配位键，故O2或其她配体需要取代Hi形成的配位键后才干与血红素结合。此外，g和Cygb具有链内二硫键。Ig是一类由B淋巴细胞分泌的糖蛋白，可与特异的抗原结合而激发特定的免疫反映。g由2条重链和2条轻链构成，分子内有大量的二硫键。多肽链分为C区和V区。IgG的二级构造几乎全是折叠，由无规卷曲连接。IgG的三级构造由12个球形构造域构成,每个均被二硫键锁住。抗体在结合抗原的前后，其构象从Y型变成T型。生物膜的多种功能是由多种构造不同的膜蛋白完毕的。膜蛋白可分为外周蛋白、内在蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白与非膜蛋白具有相似的二级构造元件，其中螺旋是最常用的二级构造,折叠也时

31、有发现。目前常使用的功能预测法重要涉及:基于序列的途径、基于构造的途径、构造与序列比对法、基于模体的措施和基于“连坐”的功能预测等。第四章 蛋白质的性质、分类及研究措施科学故事：NGF的纯化NG是一种扩散性分泌多肽，其作用是增进神经元的存活(neural urvival）和分化。Rta ev-Monalcii始终在Vcto Hamburr实验室从事神经胚胎学（uroebryology)的研究，重要研究移植或清除鸡趾对神经系统发育的影响。她在研究中发现，移植的鸡趾不仅能发育,并且还能受到神经的支配(innevated）。神经解剖显示，受神经支配的鸡趾大小与在合适的位置支配鸡趾的神经元数目相吻合,

32、即移植的鸡趾越大,支配它的神经元数目就越多。进一步研究表白,移植多余的鸡趾不仅可以增长支配它的神经元数目,并且还能增长位于其她位置不是支配它的神经元数目。于是,她觉得也许有一种扩散性的分泌因子，可以在一定的距离范畴内增长神经元数目。不久她设计了一种很巧妙的实验证明了这个设想:她将某些组织（甚至肿瘤组织)添加到鸡胚尿囊膜(chickembryochorioalantoic mrane）的上方,成果能增长正在发育中的胚胎内的神经元数目。鸡胚尿囊膜是将胚胎与鸡蛋气袋分开的一层膜,它能让气体和小分子物质通透,但细胞不行。这阐明在组织液中一定存在某种可以通过鸡胚尿囊膜的因子,从添加的组织扩散到鸡胚内，控

33、制神经元的命运。于是LeviMntalcini决定开始纯化这种神秘的因子。然而,在当时，对于这种因子的化学本质还一无所知。并且也不懂得这种因子真正的生理功能是不是就是提高神经元的数目。只是到了后来，才证明它就是一种神经生长因子,其功能是在胚胎发育的晚期控制神经细胞死亡的数目，而导致神经元数目增长和神经节(galia)增大。就像纯化其她任何一种蛋白质同样,在纯化NG之前,必须一方面建立一种有效的测定其活性的措施。但就当时的研究水平，研究人员只能在对鸡胚进行神经解剖后来,通过测量神经节的大小和存活在神经节的神经元数目来测活。而在正在发育的鸡胚中,进行这样的解剖显然既耗时又啰嗦。如果以此作为测定NG

34、F活性的基本，那么整个纯化工作的进展将会极其缓慢。Li-Montalcii在乎识到使用上述鸡胚测活系统的困难后来,决定去巴西大学的Crshagus实验室学习神经组织培养技术,以改善她的测活措施。由于当时的Carloshagus实验室已成功地从幼小动物分离出背神经节（dorsalroot gano，DRG），并可以让它们在培养液中存活。对已分离的G的解剖要简朴得多。作为一种访问学者,LeiMontacni有一种惊人的发现：带有一种肿瘤组织（代号为S-180）的DRG在培养中，DG的形态发生了很明显的变化。通过度析，发现本来从构成DG的神经元上伸出了诸多突触。这个发现是一种重要的突破，它不仅显示了

35、某种扩散性分子的存在,并且提供了一种很以便的用于纯化这种分子的测活手段。使用G测活非常重要。一方面，这种措施很以便,易于迅速测定,但测定的生物活性跟最初的生活活性已有微妙的变化（测定突触的增长，而不是本来的神经元数目的增长)。这种测活手段后来成为寻找新的增进神经生长的因子的一种原则。也许，这样的因子也许(也也许不）提高神经元的数目。事实最后证明，NGF具有双重活性。因而活性测定措施的变化没有影响到对NGF自身的纯化。但如果参与神经伸展和增进神经元存活的不是同一种物质，那么Lev-Montlin纯化到的将是此外一种因子。Li-ontalini是幸运的，由于NG同步具有两种活性。有了这种测活措施，

36、-ontacni开始尝试从-180组织中纯化GF。但不幸的是，-180中的NG浓度很低，运用当时的纯化技术(20世纪5年代初期),活性很容易损失，因此并没有获得成功。然而,就在差不多的时候，人们意识到,在蛋白质纯化中使用蛋白酶部分水解组织,有助于蛋白质的溶解。在当时,蛇毒常常被作为蛋白酶较好的来源，于是她也用蛇毒对-180的抽取物进行理解决。成果她意外地发现,蛇毒解决可以导致抽取物中N生物活性的明显提高。对照实验表白,升高的生物活性是从蛇毒中得到的,而不是来自S18。这个发现促使Lvi-Montacini考虑使用蛇毒来替代S-8组织作为分离NF的材料。蛇毒的确是NGF较好的来源,但获取大量的蛇

37、毒并非易事。于是。Li-onalci想到从其她与分泌蛇毒的腺体有关的组织中寻找G。不久发现,小鼠唾液腺是NGF的丰富来源，并且它比蛇毒更容易获取。于是，纯化NF的原材料又转到了唾液腺。一种有趣的问题是，存在于小鼠唾液腺中的NGF就是本来始终想从S-180组织中得到的NF吗？在0世纪80年代,Jhnagr和PaDAmo已经发现,一种被称为酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibrbat rh actor,FG）的蛋白质可以导致PC12细胞(一种神经元分化细胞株）的突触伸展。那么,是不是S-18产生的不是而是酸性GF呢?于是，有人使用肝素亲和层析柱对S80抽取物进行分离,成果得到大小相似的两个峰

38、，第一种峰洗脱的位置与酸性FG重叠,另一种刚好在NF的位置!面对这样的成果，我们真应当为LvMontacini感到庆幸：如果她始终使用S10作为分离N的来源,并且只收集第一种峰的话,那么最后被她纯化到的蛋白质一定是酸性的FF。此外一段趣事来自对一种被称为表皮生长因子（epidem growt fat，GF）的蛋白质的纯化。在NGF被纯化后来，需要制备它的抗体。于是，将F的制备物注射到兔子体内以产生抗血清，然而，在注射给刚出生的兔子的时候，发现被注射的“兔宝宝”不久睁开了眼睛。Cohen决定使用这种分析措施来检测那种增进睁眼的物质的生物活性,这是鉴定和纯化E的第一种线索。后来，G得到纯化,并被证

39、明是一种增进细胞分裂的蛋白质。如果阅读几篇有关GF纯化的初期论文(Varon et a,Biochsty，：222,196或Bocchii and Anglett,PNA64:7,196)，你会发现那时的纯化需要诸多环节，似乎有点劳民伤财,但正是她们的初期工作使得NGF的构造最后得到拟定。而随着人们对GF构造理解的进一步，研究者才可以设计出更迅速、更有效的纯化方案。obley建立的两步迅速纯化程序就是基于唾液腺最初分泌出来的GF和几种其她蛋白质分子形成复合物的这种信息。该复合物被称为7S N。如果将从唾液腺制备的抽取物的杂质除去,然后直接通过羧甲基纤维素柱(carboythyl-celuoe

40、comn）,几乎没有任何杂蛋白能被除去,于是就没有GF的富集。但如果调低从这种柱的流出液的pH，发现某些物质开始沉淀,7 G发生解离，形成-NGF。如果再将溶液调回到本来的第一次柱层析中使用pH和盐浓度后来，上第二根柱,那么-NG就被吸附在柱子上，而大多数杂蛋白直接流出。再通过高p和高盐溶液洗脱后,NGF被洗脱下来，其纯度可达9%。小结蛋白质的基本性质涉及:紫外吸取、两性解离、胶体性质、沉淀反映、变性、水解和颜色反映等。蛋白质的紫外吸取是由三种芳香族氨基酸导致的，最大吸取峰在280 m,它是测定溶液中蛋白质含量的迅速简便措施。蛋白质也能发生两性解离,具有I，但不能直接计算,可使用等电聚焦的措施

41、测定,I处蛋白质的溶解度最低。一种可溶性蛋白质分子在水中具有电泳、布朗运动、丁达尔现象和不能通过半透膜等典型的胶体性质。蛋白质分子表面的极性基团很容易吸附水分子，形成水化膜。水化膜的存在使得蛋白质颗粒彼此不能接近,增长了蛋白质在溶液中的稳定性，避免它们从溶液中汇集或沉淀出来。但凡能破坏水化膜以及能中和表面电荷的物质均可使蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质的措施有:盐析、 沉淀、有机溶剂和重金属盐。蛋白质变性是指蛋白质受到某些理化因素的作用,其高档构造被破坏、生物活性随之丧失的现象。导致蛋白质变性的有物理因素和化学因素。某些蛋白质的变性是可逆的,但大多数蛋白质的变性是不可逆的。蛋白质变性后来,其理化性质发

42、生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。由于蛋白质折叠状态与去折叠状态的能量差别比较小，因此有时一种点突变就能明显变化一种蛋白质对热的稳定性。从某些生存在极端环境中得到的蛋白质往往可以抵御极端因素的作用,这是由于它们的高档构造中具有更多的次级键。蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均可以发生水解。根据被水解肽键的位置，蛋白酶可以分为内切蛋白酶和外切蛋白酶。外切蛋白酶又可以分为氨肽酶和羧肽酶。蛋白质的颜色反映是指蛋白质分子中的肽键或者某些氨基酸的基团可与某些试剂产生颜色反映,这些颜色反映常常被用来对蛋白质进行定性和(或）定量分析。多肽的人工合成一般使用固相合成方式,多肽人工合成中最重要的一步是对氨基酸的氨基提供保护,以保证反映定向和有序地进行。测定蛋白质一级构造的措施有间接测定法和直接测定法。N端氨基酸测定的措施需要dan试剂或Sange试剂;C端氨基酸的测定可用酶法或化学法。如果一种蛋白质分子具有二硫键,可使用对角线电泳对二硫键进行精拟定位。在进行蛋白质纯化之前需要明确纯化蛋白质的目的、目的蛋白的测活措施和纯化蛋白质的原料。分离纯化蛋白质的多种措施都是运用蛋白质的理化性质。根据溶解性、构成、形状、功能和三维构造，可对蛋白质进行不同形式的分类。