整理免疫分析法

《整理免疫分析法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《整理免疫分析法（14页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、免疫分析法1, 熟悉免疫分析法的根底知识,了解放射免疫分析法，嗨免疫分析法,化学发光免疫分析法，荧光免疫分析法 第一：概述根本原理根本条件方法分类 免疫分析法（Immunoassay,IA）:是指以特异性抗原-抗体反响为根底的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反响的高特异 性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量，从而创立了放射免疫分析方法（Radioimmunoassay,RIA）.嗨免疫分析法，化学发光免疫分析法，荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等. 一,根本原理（一）竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反响Ag*

2、:标记抗原Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物,Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数（K二K1/K2）.抗原-抗体反响须满足以下条件：Ag*与Ag（待测物）必须是相同的生物活性物质； 所参加Ag*和Ab的量应是固定的； Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点； Ag*,Ag及Ab须处在同一反响体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量根底（二）竞争抑制曲线（剂量反响曲线）用待测物的标准品配置一系列浓度的标准溶液，再参加一定量的标记抗原和抗体待抗原抗体反响到达平衡后，测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原；F代表游离的标记抗原；

3、 T代表总的标记抗原.B/F-AgB/（B+F）X100%Ag（三）抗原一抗体反响的特点1. 特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反响 抗原的特异性主要取决于抗原决定簇（Cluster）的数量，性质及立体构型.抗体的特异性那么取决于抗原结合段（fragmentofantigenbinding,IgFab）与相应抗原结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合决定簇的结合水平.交叉反响(crossreaction):2. 可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发生在分子的外表，并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用，疏水作用,氢键作用及范德华引力等而

4、存在. 是可逆反响，改变反响条件可使结合物发生水解.3. 最适比例性抗原抗体的结合反响具有一定的量比关系只有当抗原抗体两者的分子比例适宜时，才能发生最强的结合反响.以沉淀免疫反响为例二,根本条件三种根本试剂：标记抗原，未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1. 全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反响的物质 物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体 抗原特异性(AntigenicSpecifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.1. 全抗原与半抗原全抗原：同时具有免疫原性和抗原特异

5、性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质人工完全抗原：药物(半抗原)本身不具免疫原性，只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白 质或多肽)共价结合后，才具有免疫原性这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全 抗原.2. 人工抗原的制备(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高，溶解度是否大,对化学反响合有机溶剂导致的变形作用有足够的反抗力，价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA),兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2) 半抗原的选择药物本身必须具有适宜的活性官能团，

6、如-COOH,-NH2,-OH,-C=CA.(3) 载体与半抗原的结合 碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂，将药物分子中的愈基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键 混合酸酊法 戊二醛法 琥珀酸酊法 重氮化的对氨基苯甲酸法3. 人工抗原的鉴定鉴定的目的：测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比 光谱分析法 化学分析法放射性同位素法(1) 光谱分析法结合物水解后，光谱法测定水解药物和蛋白质的含量，从而推算出它们的分子结合比.(2) 化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚，测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差异.反响出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在

7、量的药物中参加定量的放射性同位素标记药物，然后通过测定结合物中的放射性强度，便可计算出参加的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例4. 标准抗原(Standardantigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品，是免疫分析的定量依据.蛋白质，多肽类可使用纯度较低的产品，但一般不应低于90%,尤其是其中不能含 有化学结构相类似的干扰杂质，否那么会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1. 特异抗体(SpecificAntibody)特异抗体：(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反响，在血清中产生的能与该抗 原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球

8、蛋白中，免疫球蛋白G(IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2. 抗体的制备单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb):将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞，经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞该瘤细胞通过体外培养,可大量复制，产生出特异的结构相同的均质抗体，此即单克隆抗体.多克隆抗体(PolyclonalAntibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1) 免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反响的物质八水剂：抗原中参加一定量的无菌生理盐水所制成的免疫

9、原福氏完全佐剂(FreundsCompleteAdjuvant):其制法是：取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合，高压灭菌，等体积地与一定浓度的抗原混合，按3mg/ml的量参加卡介苗,研磨或于无菌注射器中对 拉，使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2) 免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反响较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊，豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内，常量免疫法的免疫抗原量通常在110mg左右，大量免疫法的免疫抗原量在 50100mg.(3) 抗血清的获得采血时应注意无菌操作，尽可能将血放人面积较大的无菌容器中，先室温凝

10、固30min左右,再放人 30C温箱约2h使凝固，最后放入4C冰箱过夜次日吸取血清，将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并 捣碎，在4000-10000r/min离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊局部采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3. 抗体的鉴定滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度滴度用免疫反响液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示，稀释倍数越大, 表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释，然后精密吸取各稀释抗血清等量，分置假设干支试管中，再于各试管中分别参加定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反响到达平衡后

11、，于反响液中加人别离剂(如沉淀剂)，别离与抗体结合的标记药物(沉 淀局部)， 测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时，其结合率趋于极值，该值称为过量抗体结合率(标记药物全被结合)， 如图中曲线的AB段，可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后，随着抗血清稀 释倍数增大，其标 记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%寸(C点)的抗血清稀释度(D点). 活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合水平活度高，说明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小抗体活度

12、上下与免疫分析方法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反响曲线的斜率上，斜率越陡,说明活度越高，测定效果越好.特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合水平与其它结构相类似的干扰物的结合水平的比拟八如果抗体与抗原的结合水平越强，而与其它类似结构的干扰物结合水平(称为交叉反响)越弱，那么 说明抗体的特异性越强.三,方法分类1. 按标记物的种类分(1) 放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2) 嗨免疫分析(enzymeimmunoassay,EIA)(3) 化学发光嗨免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CIZIA)(4)

13、荧光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substratelabeledfluorescenceimmunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(FluorescentQuenchingImmunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(FluorescentEnchancementImmunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluorescenceimmunoassay,TRFIA)2.

14、按是否参加别离剂分(1) 均相免疫分析(Itomogeneouslmmunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反响到达平衡后,反响液中结合的标记药物与游离的 标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反响液分作两相，即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析如嗨放大免疫测定技术(enzymemultipliedimmunoassaytechnique,EMIT).(2) 非均相免疫分析(heterogeneousimmunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反响到达平衡后，只有在反响液中参加别离剂,将游离 标记药物 和结合标记药物分开之后,才能测出各自局部的标记药物浓

15、度否那么，测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反响液分成液-固两相后,才能分别测定，故称为非均相免疫分析如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA)第二放射免疫分析放射性同位素标记 抗原F与B的别离技术 放射免疫测定仪标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价 应用举例 放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反响根本原理相结合的一种同位素分析技术八特点： 灵敏度高，特异性强，样品用量少，标记物容易制备以及放射性强度容易检测一, 放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元

16、素 的不稳定同位素放射性同位素在发生核衰变时，会发射出a -射线,8 -射线及Y-射线用相关仪器,即可用于于定量分析.检测产生的射线放射性强度(严格说应为放射性活度(desintegrationper-second,dps),即旧 q=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生2.放射性比度 放射性比度或称比放射1. 放射性强度):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数其单 位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变，3.7X1010次核衰变.性或比活性：放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度mcixg-1 或 mcixml-13. 放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性

17、药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比. 一般实验要求放化纯度大于90%.(二)标记抗原(IabeledAntigen)标记抗原又称放射性标记药物，供标记的药物通常应是待测药物的纯品标记抗原的纯度决定RIA的特异性,而标记抗原的放射性比度那么决定RIA的灵敏度因此，标记抗原是RIA测 定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求 有高的放射性比度； 标记后抗原仍具有原来的抗原性；标记物稳定性要好，不致因辐射引起化合物分解.2. 标记放射性同位素的选择125I的特点是： 化学性质活泼，易于标记； 标记物在衰变中放出的Y -射线能量较高，易于测定； 标记物的放射线半衰期相对较短

18、,须经常标记； 碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团，易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是： 用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度； 标记后的药物的抗原性不会受到影响，由于氢原子的半径较小，且3H只是与药物分子 的1H发 生交换，不涉及化学元素的改变 3H的半衰期很长,可达1216年； 3H发射出的8射线能量较低，须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度.三标记方法1.1251标记抗原的制备取代反响将其标记在药物或药物的衍生物上八用碘标记时一般采用氧化法，常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等，目前应用最多的是氯胺T氧化法是指先用氧化剂将放射性

19、碘离子I-氧化成游离的放射性碘分子12，然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸 ，组氨酸或含酚基的衍生物，然后再进行标记，使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法八非定位标记通常采用气体曝射法，即将药物与M3H气密封在一起，放置几天或几周，使3H与药物分子的1H 发生交换定位标记采用特殊的合成路线，即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物 前体，然后再对双键部位进行催化加H.这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二, F与B的别离技术游离的标记药物F和结合的标

20、记药物B1, 沉淀法2, 吸附法3, 固相法4, 双抗体法一沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀，从而可使与蛋白抗体相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物 由于未与蛋白结合，便留在于溶液中.常用的沉淀剂：硫酸铉，亚硫酸氢钠，乙醇，异丙醇.方法:在免疫反响到达平衡后的反响液中参加一定量的饱和硫酸铉溶液，使最终浓度为1.6-2.0mol/L约40%-50%勺饱和度，立即混匀，在4C条件下反响2030min后，离心， 别离沉淀物，用40%勺硫酸铉饱和溶液洗涤沉淀，然后测定放射性强度.优点：快速，简便，价廉.缺点:不能使F和B完全别离，沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较 高.二吸附法吸附法是

21、利用固体吸附剂能在反响液中吸附游离抗原的原理而使F与B别离.常用的吸附剂：右旋糖酊包裹的活性炭DextronCoatedCarbon,DCC，纤维素，硅酸盐等.原理：DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酊的分子筛作用，使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附，而与抗体相结合的药物由于分子体积大那么不能 通过网眼而被留在液相中.方法：当免疫反响到达平衡后，于反响液中参加DCO附剂，待吸附达平衡后，离心离心后的结果正好与沉 淀法相反，上清液中是与抗体相结合的标记药物B，而沉淀中那么是游离的标记药物F.优点：快速，简便缺点：如药物一抗体结合物的离解常数较高时，测定结果不稳定.三固

22、相法原理：通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体外表，待抗原与抗体形成结合物B后就附在固相物上,而游离的抗原F那么仍留在反响液中，从而实行别离.该法实质上是一种固相免疫测定法solid-phaseimmunoassay，其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶，聚苯乙烯,纤维素，试管等.方法：采用试管固相法，即将抗体直接附着于试管底部的内壁上，测定时于试管中参加样品和试剂，当放射免疫反响到达平衡后,结合物就附在管壁上，游离抗原那么留在液相中通过离心或 米用简单倾去法便可将两相别离优点：简便，快速，实用.缺点:有时难以获得重复的结合率，其次是固相载体本身也有可

23、能吸附游离标记药物，导致结果误差增大.四双抗体法别离原理：药物半抗原与抗体结合后，虽然分子量增大,但还缺乏以生成沉淀而处于溶解状态，这种抗 体通常被称为第一抗体，它可通过将抗原注入家兔，豚鼠等动物体内免疫获得然 后再将第一抗体 作为新的抗原注入羊，马,牛等较大动物，那么可免疫获得第二抗体抗一抗体当往第一抗体的反响液中参加第二抗体后，第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大，从 而生成沉淀离心后与抗体结合的标记药物抗原-第一抗体-第二抗体结合物处在沉淀中，而游离的标记抗原那么留在上清液中.优点：别离效果好,适用范围广.缺点：抗体的制备有一定难度，且操作流程较长.三, 放射免疫测定仪一类是T计数器.C

24、ounter其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体，为提升其发光效率，还 在晶体内参加有0.1%-0.5%的铭作为激活剂，该仪器适合测定1251,1311等同位素发射出的能量 较高的8-射线.一类是液体闪烁测量仪LiquidScintillationCounter，由于该仪器放出的8射线能量低,射程短，不可能穿人和激发固态闪烁晶体，而只能在特定的闪烁液中进行，由8 -射 线激发液 体闪烁剂而产生闪光现象该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的8 -射 线.一 测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的8-射线能作用于闪烁液而发出荧光闪光，该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变

25、次数有关，通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1溶剂作用：溶解闪烁剂和放射性样品；同时还起着吸收和转移8-射线能量的作用.条件：溶剂分子必须具有高度共弛的双键，只要受到能量低的8 -射线的辐射，其兀电子就能跃 迁至激发 态.一类是烷基苯类，甲苯，对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等，主要适用于脂溶性药物的测定另一类是酰类,1,4- 二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2闪烁剂作用：接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量T激发态T基态T发射出闪烁的荧光光子T光电倍增管T光电转换测量系统记录.要求：性能稳定，闪烁效率闪烁剂放出光子的能量高,淬灭耐受性好，发光衰减时间短.常用的闪烁剂有：对联三苯TP，

26、2,5-二苯基恶0坐PPO，2-苯基-5-4-联苯基-1,3,4- 恶-二0坐PBD等.二仪器简介1. 计数瓶计数瓶或称闪烁杯：一个具盖的玻璃或塑料小瓶10 20m1，用于盛装样品和闪烁液当放射性药物分子与闪烁液接触时，溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂，闪烁剂将吸收的能量转变为光能荧光，荧光透过计数瓶壁，进入光电倍增管.2. 光电倍增管光电倍增管：光阴极，倍增极和阳极构成进入光电倍增管的荧光光子通过光阴极外表的透明面板后，直接 撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子，光电子经数个倍增极依次放大，使电子数剧增这些电子最后被阳极收集，产生一个电压脉冲，并由记录器记录 下来3. 记录器用于记录

27、单位时间内所产生的电压脉冲数，该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核 衰变次数闪烁次数通常米用每分钟计数countsperminate,cpm，作为放射性同位素药物的放射性强度.四，标准曲线的制备与样品测定步骤一 标准曲线的绘制取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.参加定量标记抗原，其总放射性T应能满足准确测量的需要.参加定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原，标记抗原，特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反响平衡后测定总计数率 T.参加别离剂，使结合局部B与游离局部F别离.测定各管结合局部或游离局部的计数率.标准曲线通常以标准抗原

28、待测药物标准品的浓度为横坐标，以结合率B%为纵坐标作图. 纵坐标B%勺计算有两种方法：一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度B与参加的标 记药物总放射性强度T比拟，即B%=B/TX100%另一种是用零标准管不加药物标准品的 放射性强度B0代替T比拟，即B%二B/BOX100%.二样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理：测定方法不够灵敏，可将被测物适当浓集；测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质别离；待测物以缀合物形式存在，可设法使其游离，然后进行测定.例:125I-RIADCC沉淀法测定血清中地高辛浓度待测血清样品50 111样品管中；含不同浓度地高辛标准品的血清50111标准曲线各管中

29、；50 &1空白人血清1零标准管各管中依次参加保温液100从11抗体溶液100 曰125I标记的地高辛溶液100曰摇匀1在室温15 25C放置30mi2 -计数器测定各管的总计数T即加人的T协I总放射性剂量1在电磁搅拌或手摇下,迅速向各管内加人1ml工作液全部加完限制在 5min内，摇匀1离心10min3000r/min1倾去 上清液1訂计数器测定各管中沉淀的计数F游 离协I地高辛放射性强度J十算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五，方法评价灵敏度高，特异性强，取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原，其放射性对操作人员的健康，对环境的污染都会造成危害，而且还需 有专用的同位

30、素实验室及免疫测定仪器，本钱较高，因而使其普及受到限制.六,应用例如固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1. 主要试剂2测定方法3. 结果计算1标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线以地高辛标准品血清浓度为横坐标，但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线，当测得 血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后，也可从标准曲线上得到对应的血 清药浓(2) 回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度)，以logitY为因变量进行直线回归第三嗨免疫分 析法嗨标记抗原均相嗨免疫

31、分析非均相嗨免疫分析方法评价应用例如嗨免疫分析(EnzymeImmunoassay,EIA)是以嗨作为标记物的免疫测定方法嗨免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的根底上开展产生起来的一种新的免疫分析方法 一，嗨标记抗原(一) 标记嗨的选择特异性强，嗨蛋白分子中应具有足够的活性基团，以便能与药物结合.活性要高，即当底物浓度低时，确有较高的催化反响率.嗨的活性不易受样品中其它成分影响，有较好的稳定性.嗨的纯度要高，且生物体液中应无标记嗨，底物，抑制剂及其它干扰物质存在. 嗨的活性测量方法应简单，灵敏，精密和快速.嗨的来源，纯化，供给等应方便,价廉.最常用的标记嗨1. 辣根过氧化物嗨(

32、HRP):约有50%勺EIA使用此嗨.2. 碱性磷酸酯嗨(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢嗨(G-6-PD):通常用于均相EIA.4. 8 -半乳糖吾嗨(8-Gal):适用于均相EIA和非均相EIA.5. 苹果酸脱氢嗨(MDH):多用于尿样的均相EIA.(二) 底物的选择 无色,无毒能溶水； 化学性质稳定，不受光照的影响； 转化率高，在嗨催化下可产生大量的有色物质； 显色产物的量在一定范围内与嗨的浓度或活性成正比； 应有终止嗨反响的试剂.常用嗨的底物1, 辣根过氧化物嗨的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯

33、胺及其硫酸盐 (TMB/TMBS)2, 碱性磷酸嗨底物：对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3, 8-D-半乳糖吾嗨底物:邻硝基苯-8-D-半乳糖毗喃吾(o-NPG),氯酚红-8-D-半乳糖 毗喃吾(CPRG)试 卤灵-D-半乳糖毗喃吾(RG)4, 葡萄糖氧化嗨底物:与辣根过氧化物嗨底物相同(三) ：嗨标记药物的制备嗨标药物的嗨活性和免疫活性决定了嗨免疫测定法的灵敏度，因此嗨标药物成为EIA的关键.选择制备方法应注意以下原那么：(1) 对嗨和抗体的活性没有影响(2) 生成的结合物是可溶的,稳定的(3) 反响条件易限制(4) 制备方法简单，能重现二均相EIA均相

34、嗨免疫分析(HomogeneousEnzymelmmunoassay)是指嗨标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的嗨标抗原一抗体结合物(AgEAb)可使 嗨的活性发 生改变(增强或减弱)，且不需将游离的嗨标药物(AgE)与结合的(AgE Ab)嗨标药物分开,就可直 接通过测定嗨活性的变化，求出样品含量的方法.嗨增强(放大)免疫测定技术(EnzymeMultipliedImnunoassay,technique,EMIT),或称结合嗨免疫分析 法(一) 测定原理EMIT法通常使用6-磷酸葡萄糖脱氢嗨(G-6-PD)作标记嗨，其原理是标记在待测药物上的G-6-PD 在辅嗨I参与下能将底物6

35、-磷酸葡萄糖(G-6-P)氧化成6-磷酸葡萄糖酸,而辅嗨I本身那么被复原 成复原型辅嗨I(NADH).在该反响过程中，辅嗨I的结构发生了变化，导致NASNADH勺紫外吸收光谱形状不同，复原型辅嗨 I在340nm处有最大吸收，而辅嗨I在此波长处那么吸收甚小.(二) 测定方法未标记药物(Ag)+抗体+辅嗨I(NAD)+底物(g-6-p)t抗原-抗体结合物Ag-AtrAW标药物(AgE).嗨标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab),当这种竞争结合反响到达平衡之后，那么有局部嗨标药物与抗体相结合，从而使结合嗨标药物(AgE-Ab)上的嗨活性受 到抑制，不能再同底物发生作用,而只有游离嗨标药物(A

36、gE)上的嗨才有活性，能作用于底物产生测 定信号如果样品中待测药物的浓度越高，那么竞争抑制的结果使游离嗨标药物的量增多,亦即嗨 的活性随着待测药物浓度的增加而增强，故有嗨增强免疫技术之称.由于游离嗨标药物量的增多，能使更多的NAO与氧化反响，生成更多的嗨反响产物NADH.根据 NAD盼340nm处有紫外吸收的原理，便可用分光光度计测定吸收度,求出待测药物的含量.三,非均相EIA非均相免疫分析:指嗨标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，形成的嗨标抗原-抗体结合物(AgE-Ab)与游离 的嗨标抗原(AE) 样,其标记嗨都具嗨活性因此必须将AgE-Ab与游离 的AgE分开后，再测定嗨 活性的变化，以

37、求出待测药物的含量.嗨联免疫吸附测定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA):将一种反响物固定在固相载体上， 当另一种反响物与其结合后，可通过洗涤，离心等方法将液相中未结合的其它物质倾去，然后测定 结合在固相上的嗨活性.(一) 测定原理(二) 测定步骤竞争法是将抗体直接吸附在有小孔的反响板孔内，然后将待测样品和定量的嗨标药物加入孔内并混匀将反响板置于适宜温度下温育一定时间，待嗨标药物与未标记药物的竞 争结合反 响到达平衡后，洗去未同抗体结合的游离药物，而与抗体结合的嗨标药物和未标记药物固相载 体沉淀局部那么保存在孔内然后将底物参加孔内，结合在抗体上的嗨标药物

38、能催化底物，发生 水解，氧化或复原等化学反响，从而产生可测信号测定时以空白试验孔内不加待测样品作参 比.四，方法评价ElA优点：防止对人体的放射性伤害，环境的污染 嗨标记物较稳定,半衰期可超过1年.嗨免疫反响通常不需要不需要温育不需将与抗体结合的标记药物同游离的标记药物分开，便可直接测定. 产生的信号用普通的可见一紫外分光光度计就可测定，不需昂贵的仪器没备. 缺点：标记嗨不像同位素标记物，荧光标记物那样能直接产生信号，而必须要何其它试剂，如嗨底物，辅嗨的参与，才能完成嗨反响，引起吸收光谱等变化前方可进行测定.五，应用例如血样中利多卡因的测定1. 药物与试剂试剂A:内含抗体由利多卡因与大分子载体

39、结合成人工抗原后免疫绵羊而得底物G-6-P及辅嗨 INAD保存剂0.05mol/Ltris-HCl 缓冲液.试剂B:内含嗨标药物用G-6-PD标记的利多卡因及保存剂pH7.9.其它试剂：标准品和质控对照品0.055mol/Ltris -HCl缓冲液2. 样品测定精密量取血浆或血清样品50曰，于2ml小烧杯中，参加TB缓冲液250曰,混匀后，吸出5从1置另一 2ml小烧杯中,再参加TB缓冲液250曰,充分混匀然后参加试剂A50曰及TB缓 冲液250从1,再参加试剂B50曰及TB缓冲液250从1,混匀,立即将反响液吸入分 光光度计的样 品池中，在340nm波长处测吸收度根据标准曲线，求出血样中利多

40、卡因的浓度.3. 标准曲线的制备将药盒提供的6个装有不同量的利多卡因标准品小瓶取出，在每瓶中参加1.0ml蒸偕水，即得到浓 度分别为0丄02030,5.0及12.0mg/L的标准品溶液然后分别吸取不同浓 度的标准品溶液50少1 代替血清样品，按样品测定方法同样操作以吸收度为纵坐标，标 准品溶液浓度为横坐标，在半对数 纸上作图，即得标准曲线并将另一瓶利多卡因质控对照品参加3.0ml蒸偕水，得浓度为4.0mg/L, 供核对标准曲线用.第四:化学发光免疫分析定义:是将化学发光反响的高度灵敏性和免疫反响的高度专一性结合起来，用于超微量物质的一种检测技术.直接化学发光物质标记法化学发光嗨免疫分析法第五：荧光免疫分析定义:是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的荧光标记物能与抗体发生免疫反响，引起荧光强度发生变化的一种分析方法，fluorescenceImmunoassay,FIA