微生物群落多样性测序与功能分析

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1、微生物群落多样性测序与功能分析微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序,通过度析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成状况或基因的构成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差别分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序涉及两类，一类是通过 rNA，18 rN,IS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；尚有一类是宏基因组测序,是不通过度离培养微生物,而对所有微生物DA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成,挖掘有应用价值的基因资源。以16sNA扩增进行测序分析重要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学

2、分析也可以基于16srDN的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种(peci）（一般只能对部分菌进行种的鉴定)，甚至对亚种级别进行分析，几种概念：16 rDNA(或16S rRA）:16S RNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为152bp,其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。6 r基因序列涉及9个可变区和0个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差别。6S rRNA基因测序以细菌6 rRN基因测序为主,核心是研

3、究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。OTU：opratinal taxonoicut (T）在微生物的免培养分析中常常用到,通过提取样品的总基因组DNA,运用16S rRNA或IS的通用引物进行PCR扩增,通过测序后来就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么辨别这些不同的序列呢,这个时候就需要引入opratil taxonomc unis，一般状况下,如果序列之间，例如不同的 6S rR序列的相似性高于97%就可以把它定义为一种OU，每个OTU相应于一种不同的 rRNA序列,也就是每个OTU相应于一种不同的细菌(微生物)种。通过OTU分析，就可以懂得样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。

4、测序区段:由于16s rDNA较长(5kb）,我们只能对其中常常变化的区域也就是可变区进行测序。16s rN包具有9个可变区,分别是v-v9。一般我们对v34双可变区域进行扩增和测序,也有对v-区进行扩增测序。工具原料 1s rDNA测序一方面需要提取环境样品的DNA，这些DA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。 提取DNA后需要通过质检和纯化,一般16s rDNA测序扩增对DN的总量规定并不高,总量不小于100g，浓度不小于1u一般都可以满足规定。如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物，提取时也许涉及了寄主自身的大量DNA，对DA的总量规定会提高。微生物菌群多样性测序受DN提取和

5、扩增影响很大,不同的扩增区段和扩增引物甚至C循环数的差别都会对成果有所影响。因而建议同一项目不同样品的都采用相似的条件和测序措施,这样互相之间才存在可比性。 完毕PCR之后的产物一般可以直接上测序仪测序，在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化，一般要进行荧光定量PCR。完毕定量的样品混合后就可以上机测序。 6s DA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，涉及罗氏的454,Illumia的iq，Lif的PG或Pacb的RSII三代测序仪。不同的仪器各有优缺陷,目前最主流的是Ilmina公司的ieq，由于其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MSeq测序仪可以产生2x300bp的测序读

6、长，一次可以产生1Gb的测序数据远远不小于其她测序仪的测序通量。措施/环节1. 116s rDNA分析基本流程:2. 原始数据解决:原始测序数据需要清除接头序列,并将双端测序序列进行拼接成单条序列。根据测序barcode序列辨别不同的样本序列。过滤低质量序列和无法比对到1s DNA数据库的序列。3. OTU分类和记录：OTU（operatonaaxonmc un） 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析，人为给某一种分类单元(品系，种,属，分组等）设立的同一标志。一般按照 9 的相似性阈值将序列划分为不同的TU,每一种 OTU 一般被视为一种微生物物种。相似性不不小于97%就可

7、以觉得属于不同的种，相似性不不小于93%95%,可以觉得属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OT的分析。使用QIIE（ersion 1.8.)工具包进行记录注释。使用QIIM（rsi19., )的custer措施根据7的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成orational taxonomi us (OTs)。然后与数据库GrnGs（versiong_13_8, ）进行比对,比对措施cus,identity 09 。然后对每个TUs进行rads数目记录。下面的2个表,其中一种表是对每个样本的测序数量和T数目进行记录，并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度(显示前10个

8、样本)。另一种表是对每个样本在分类字水平上的数量进行记录，并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目（显示前10个样本)。可以看到绝大部分的TU都分类到了属（Genus），也有诸多分类到了种（pecies)。但是仍然有诸多无法完全分类到种一级,这是由于环境微生物自身存在非常丰富的多样性，尚有大量的菌仍然没有被测序和发现。测序数目登记表重要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行记录，并且在表格中列出了测序覆盖的完整度(显示前10个样本，如果样本超过10个,请查当作果中otu_stat.tx文献）其中 apleNae表达样本名称;SmpleSize表达样本序列总数；OTUumber表达注释上的

9、OTU数目;OTsSeq表达注释上OU的样本序列总数。oveag是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序成果与否代表样本的真实状况。计算公式为:1n/N其中n 只具有一条序列的TU的数目;N = 抽样中浮现的总的序列数目。分类水平登记表重要是对每个样本在分类学水平上的数量进行记录，并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目（只显示前10个样本,如果样本超过10个,请查当作果中taxon_.txt文献）其中mpleNme表达样本名称；lum表达分类到门的OT数量;ass表达分类到纲的OT数量；Orde表达分类到目的T数量;Family表达

10、分类到科的OTU数量；n表达分类到属的OTU数量；Spcs表达分类到种的OTU数量。4. 4我们还可以对这些种属的构成进行柱状图显示:横坐标中每一种条形图代表一种样本，纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。同一种颜色代表相似的分类级别。图中的每根柱子中的颜色表达该样本在不同级别(门、纲、目等）的序列数目，序列数目只计算级别最低的分类,例如在属中计算过了,则在科中则不反复计算。: 为什么要选择3V4区的测序长度？为什么有些文献是V6区,有什么区别?A:16SrRNA总长约10p,涉及 9个可变区。由于高通量测序的测序长度的限制,不也许将1S RN的9个可变区所有测序，因此在PCR扩增时往往只能选

11、择1-3个可变区作为扩增片段。Kozic 等评估了sq测序仪分析的不同16 rRNA可变区的精确性发现，测定 4区效果最佳。根据我们的测序长度,v3v4区是最佳选择。5. 5我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图：注意，韦恩图目前一般最多只能显示5个样本或分组,过多的样本无法无法进行韦恩图绘制6. 6样品构成丰度:稀释曲线微生物多样性分析中需要验证测序数据量与否足以反映样品中的物种多样性，稀释曲线（丰富度曲线）可以用来检查这一指标。稀释曲线是用来评价测序量与否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富限度。稀释曲线是运用已测得1SrNA序列中已知的多种TU的相对比例,来计算

12、抽取n个（n不不小于测得eads序列总数）reads时浮现TU数量的盼望值,然后根据一组n值（一般为一组不不小于总序列数的等差数列）与其相相应的O数量的盼望值做出曲线来。当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以觉得测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种；反之,则表达样品中物种多样性较高,还存在较多未被测序检测到的物种。下图中的稀释曲线横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表观测到的OT数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量,如果曲线趋于平坦表白测序已趋于饱和，增长测序数据无法再找到更多的OTU；反之表白不饱和,增长数据量可以发现更多OTU。7. 7Shnnon-Winer曲线Sh

13、non-Weer 曲线,是运用sno指数来进行绘制的,反映样品中微生物多样性的指数,运用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 当曲线趋向平坦时，阐明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。与上图同样,横坐标代表随机抽取的序列数量；纵坐标代表的是反映物种多样性的ho指数。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量,如果曲线趋于平坦表白测序已趋于饱和，增长测序数据无法再找到更多的OTU；反之表白不饱和,增长数据量可以发现更多T。其中曲线的最高点也就是该样本的Sanon指数,指数越高表白样品的物种多样性越高。

14、Q:nnon指数怎么算的？A: Shon指数公式：其中,os实际测量出的OTU数目;n=具有 条序列的TU数目；N=所有的序列数。8. 8RakAdance曲线用于同步解释样品多样性的两个方面,即样品所含物种的丰富限度和均匀限度。物种的丰富限度由曲线在横轴上的长度来反映,曲线越宽,表达物种的构成越丰富；物种构成的均匀限度由曲线的形状来反映，曲线越平坦,表达物种构成的均匀限度越高。一般超过2个样本图就会变得非常复杂并且不美观,因此一般20个样本如下会做该图，图片保存为成果目录中rn.pd。横坐标代表物种排序的数量;纵坐标代表观测到的相对丰度。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量，如果

15、曲线越平滑下降表白样本的物种多样性越高，而曲线迅速陡然下降表白样本中的优势菌群所占比例很高,多样性较低。9. 9多样性（样本内多样性)Alpha多样性是指一种特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量指标有Chao1丰富度估计量（hao1rihnss estimato） 、香农 - 威纳多样性指数(hanonwiene diersydx）、辛普森多样性指数（Sipon divesiy dex)等。计算菌群丰度:Chao、ce；计算菌群多样性:Sannon、Simso。Simpso指数值越大，阐明群落多样性越高;Shannn指数越大,阐明群落多样性越高。表中显示前10个样本,如果样本不小于1个，

16、详见成果目录中的aladi.tt。Q: 能不能解释下每个指数（如a1、shanno）?A: Cha1:是用cao1算法估计群落中含OU 数目的指数,hao1 在生态学中常用来估计物种总数,由Cao （1984) 最早提出。Cho值越大代表物种总数越多。Sca1=Sosn(n11)2（n1)其中Scho1为估计的TU数，Sos为观测到的OU数,n1为只有一条序列的OU数目,n2为只有两条序列的OU数目。Shanon:用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与 Sipsn多样性指数均为常用的反映 apa 多样性的指数。Sannon值越大，阐明群落多样性越高。Ace:用来估计群落中具有OTU数目的指

17、数,由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一,与hao1 的算法不同。imson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Ewad HuhSimpon （ 1949）提出,在生态学中常用来定量的描述一种区域的生物多样性。Smpson指数值越大,阐明群落多样性越高。辛普森多样性指数=随机取样的两个个体属于不同种的概率=1-随机取样的两个个体属于同种的概率10. 10Ba多样性分析（样品间差别分析）Bta多样性度量时空尺度上物种构成的变化,是生物多样性的重要构成部分,与许多生态学和进化生物学问题密切有关,因此在近来间成为生物多样性研究的热点问题之一。PCoA分析PoA（pricipa

18、lco-ordnts analysis）是一种研究数据相似性或差别性的可视化措施,通过一系列的特性值和特性向量进行排序后，选择重要排在前几位的特性值,PCoA 可以找到距离矩阵中最重要的坐标，成果是数据矩阵的一种旋转,它没有变化样品点之间的互相位置关系,只是变化了坐标系统。通过PCo 可以观测个体或群体间的差别。每一种点代表一种样本,相似颜色的点来自同一种分组,两点之间距离越近表白两者的群落构成差别越小。Co有多张图,分别代表的C12，23,31。11. 11NDS分析（非度量多维尺度分析)NMDS（ontrc Mulidimenionl caling)常用于比对样本组之间的差别，可以基于进化

19、关系或数量距离矩阵。横轴和纵轴：表达基于进化或者数量距离矩阵的数值在二维表中成图。与CA分析的重要差别在于考量了进化上的信息。每一种点代表一种样本，相似颜色的点来自同一种分组,两点之间距离越近表白两者的群落构成差别越小。12. 12PCA分析主成分分析C(Principa coonet nls）是一种研究数据相似性或差别性的可视化措施,通过一系列的特性值和特性向量进行排序后,选择重要的前几位特性值，采用降维的思想,PCA 可以找到距离矩阵中最重要的坐标，成果是数据矩阵的一种旋转，它没有变化样品点之间的互相位置关系,只是变化了坐标系统。具体有关主成分分析的解释推荐人们看一篇文章,。通过PCA 可

20、以观测个体或群体间的差别。每一种点代表一种样本,相似颜色的点来自同一种分组，两点之间距离越近表白两者的群落构成差别越小。以上三个图也许遇到的问题:1:PC，PoA,NDS分析分别是基于什么数据画的?回答:CA，PoA,NMDS分析均是基于OTU分类taon数据所画,用的是R语言egan包中的有关函数画成，其中PoA与NMD还要基于样本之间的距离矩阵才干画成。：PC分析如果图中大部分点集中在一起,少数点在很远的外围,是什么因素导致的？回答:是由于样本OTU分类时候，少数样本某些菌含量特别高所导致，导致这些样本偏离正常范畴，建议单独拿出这些样本观测，看与否是实验错误。：PCA分析时，不是有PC1，

21、C2，C3三个坐标吗?是给出三张图吗？还是三维立体图?回答:C作图时，会得出C,C2，PC3三个坐标，可以根据P12,C13,P23分别作图,一般给出的是C1的图,当PC2图质量不好,看不出明显的样本分类效果时,可以看PC13或PC23的图分类与否清晰，也可以用语言l包做出PC1三维图。QIME自身成果中有提供PC的三维图成果,可以通过网页打开。13. 13DA差别奉献分析PC和LA的差别在于，PC,它所作的只是将整组数据整体映射到最以便表达这组数据的坐标轴上,映射时没有运用任何数据内部的分类信息，是无监督的，而DA是由监督的,增长了种属之间的信息关系后,结合明显性差别原则测试(克鲁斯卡尔-沃

22、利斯检查和两两Wiloon测试）和线性鉴别分析的措施进行特性选择。除了可以检测重要特性,她还可以根据效应值进行功能特性排序，这些功能特性可以解释顶部的大部分生物学差别。具体阐明可以参照这篇文章。不同颜色代表不同样本或组之间的明显差别物种。使用Lefe软件分析获得,其中明显差别的logarithmc LDA score设为2。问题：DA分析有什么用？回答:组间差别明显物种又可以称作生物标记物(biomarkers），该分析重要是想找到组间在丰度上有明显差别的物种。14. 物种进化树的样本群落分布图是将不同样本的群落构成及分布以物种分类树的形式在一种环图中展示。数据通过度析后,将物种分类树和分类丰

23、度信息通过软件GraPhlA()进行绘制。其目的是将物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度和最高分布样本的信息在一种视觉集中的环图中一次展示,其提供的信息量较其她图最为丰富。中间为物种进化分类树，不同颜色的分支代表不同的纲（具体的代表颜色见右上角的图例）,之后外圈的灰色标示字母的环表达的是本次研究中比例最高的15个科(字母代表的科参见左上角的图例)。之后的外圈提供的是热力图,如果样本数=1个则绘制样本，如果样本数超过10个则按照分组绘制，每一环为一种样本，根据其丰度绘制的热力图。最外圈为柱状图,绘制的是该属所占比例最高的样本的丰度和样本颜色(样本颜色见环最下方的样本名字的颜色）。其中热力

24、图和柱状图取值均为原比例值x00后进行lg2转换后的值参照文献:1. aqez-Bez ,Prung M, Gnlez A， Kniht . . Emper： A toor visulizing h-trougput microbiaomunity data Ggsciece 2（1)：16. Legend, .egende,L. 1998. NuerialEcgy. ecod ngisEditionDevelopmts in nvironmental Mlln0. Elsevr,terd.3. Segata ， Izard , Waldo L, t al Meagnomi bmakr dis

25、cover n xplanatiJ. eom Bio， ， 12(6)： R60.Langille MGI, Zanevel J, Capraso JG, McDonald D, Knghts， eyes JA etal. （). rdictive functionl prilgofmirobia comuniti sig 1S rRN mrker gene sequences. Nt Bioechnl 1:848215. 物种有关性分析根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化状况,计算物种之间的有关性,涉及正有关和负有关。有关性分析使用CCRPE算法，一方面对原始6s测序数据的种属数量进行原则

26、化，然后进行Spearman和Peaso秩有关分析并进行记录检查，计算出各个物种之间的有关性，之后在所有物种中根据siscore绝对值的大小,挑选出有关性最高的前100组数据，基于Cytosca绘制共体现分析网络图，网络图采用两种不同的形式体现出来。物种有关性网络图：图中每一种点代表一种物种，存在有关性的物种用连线连接，其中,红色的连线代表负有关，绿色的先代表正有关，连线颜色的深浅代表有关性的高下。物种有关性网络图B：图中每一种点代表一种物种,点的大小表达与其她物种的关联关系的多少,其中与之有有关性的物种数越多,点的半径和字体越大,连线的粗细代表两物种之间有关性的大小，连线越粗,有关性越高。参

27、照文献：cwagr E, Winart ， Bieski C, e l. CCRE： Copitioality Corete by Ptaton an enormaliation.16. 聚类分析根据UT数据进行原则化解决(1log10）之后，选用数目最多的前60个物种，基于 hetmp进行作图,热图中的每一种色块代表一种样品的一种属的丰度,样品横向排列，属纵向排列,两个热图，差别是与否对样品进行聚类，从聚类中可以理解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。如果聚类成果中浮现大面积的白或黑是由于大量的菌含量非常低,导致都没有数值，可以在绘制之迈进行原则化操作，对每一类菌单独自身进行原则化

28、。17. 群落功能差别分析通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后,我们可以通过16s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成，从而分析不同样本和分组之间在功能上的差别(PCRSt NaurBotenology， 1-10. )。通过对宏基因组测序数据功能分析和相应16s预测功能分析成果的比较发现，此措施的精确性在84-95%，对肠道微生物菌群和土壤菌群的功能分析接近5%,能非常好的反映样品中的功能基因构成。为了可以通过1s测序数据来精确的预测出功能构成，一方面需要对原始6s测序数据的种属数量进行原则化，由于不同的种属菌涉及的6s拷贝数不相似。然后将6的种属构成信息通过构建好的

29、已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能成果。（根据属这个水平，对不同样本间的物种丰度进行明显性差别两两检查,我们这里的检查措施使用STAM中的two-sample中TET措施，Pvle值过滤为0.05,作Exnt eror ar图。)此处提供COG,KO基因预测以及KEGG代谢途径预测。顾客也可自行使用我们提供的文献和软件(STAMP）对不同层级以及不同分组之间进行记录分析和制图,以及选择不同的记录措施和明显性水平。参照文献:onvan H. Parks1 ,ene W. Tyson，STAMP: sttstcal analysis oftxonoic andfuctial poi

30、ls,Boioraic()30(1):12-324doi：10.10318. OG构成差别分析图图中不同颜色代表不同的分组,列出了OG构成在组间存在明显差别的功能分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差别的比例和置信区间以及Pvaue。19. KGG代谢途径差别分析图通过KEGG代谢途径的预测差别分析,我们可以理解到不同分组的样品之间在微生物群落的功能基因在代谢途径上的差别,以及变化的高下。为我们理解群落样本的环境适应变化的代谢过程提供一种简便快捷的措施。图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在第三层级的构成在组间存在明显差别的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差

31、别的比例和置信区间以及-valu。本例图所显示的是第三层级的EGG代谢途径的差别分析，也可以针对第二或第一层的分级进行分析。20. 基因的差别分析图除了能对大的基因功能分类和代谢途径进行预测外，我们还能提供精细的功能基因的数量和构成的预测,以及进行样本间以及组间的差别分析，并给出具有记录意义和置信区间的分析成果。这一分析将我们对于样本群落的差别进一步进一步到了每一类基因的层面。图解读：图中不同颜色代表不同的分组，列出了在组间/样本间存在明显差别的每一种功能基因(酶）以及在各组的比例，此外右侧还给出了差别的比例和置信区间以及-value。21. 在获得原则报告后如果但愿单独修改分组或对某些组之间

32、进行明显性差别分析,可以使用MP软件在自己的电脑上进行数据分析。STAMP提供了丰富的记录检查措施和图形化成果的输出。在使用STAMP之前需要一方面准备需要的spf格式文献和样品分组信息表。在我们的报告中已经将E和K以及CO的成果文献后通过转换生成了合用于SMP软件打开的sp格式文献，尚有相应的分组信息表文献gropile.txt。如下是使用STAMP时的某些有关问题,具体的SAMP使用教程可以参照我们提供的MP使用教程。1、tam作图用的原始数据的来源？SAMP 可以直接使用来自IME的iom文献和PICUST的KGG和 文献,roupfl.xt文献的格式为ta-sapratedvaue (

33、tb键隔开的数据)2、分组问题：导入数据之后，iwgrouplgnd,在窗口右侧会浮现分组栏,根据需要进行分组。3、Unclassiffie选项中，ren Unclsfied reas、rove nlassffed reads、和use ony frcalnreueny profiles 措施的区别？remai nclasifed reas和e lyforalculatin frequecy pfil措施会保存所有的数据,而reove Unclaiirds仅仅保存有拟定分组信息的数据。4、Sttitical tes中，Wlhs ttest、t-test、hitesnon-rametrc tte

34、st的区别,各自优缺陷?为了保证记录学意义和精确度和精确性，需要足够多的样本数目，t-test检查可以在至少样本数为4的时候保证高的精确度和精确性。当两个样本之间具有相似方差的时候，用t-tst更为精确,当两个样本没有相似方差，Wlchs ttest更为精确。当样本数目少于8的时候，可以使用hesnon-paameitest,该计算时间较长,当样本数目过多的时候不适宜使用该措施。5、Two-grup中ty: one sie 和 t i的区别?One side只会显示前一种grop与后一种group差别的比例,而woside两者之间的比例均会显示。、 STAMP在使用时一方面打开了一种分析文献,

35、如果新打开一种也许会导致显示错误？目前版本的SAP存在某些小问题，一次分析只能使用一种数据文献，如果要打开新的需要关闭软件后再打开。22. 环境因子分析分析CCA/DA分析基于相应分析发展的一种排序措施,将相应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归,又称多元直接梯度分析。重要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RD 是基于线性模型,CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。横轴和纵轴：RD 和C 分析，模型不同，横纵坐标上的刻度为每个样品或者物种在与环境因子进行回归分析计算时产生的值，可以绘制于二维图形中。图解读:冗余分析可以基于所

36、有样品的OTU作图,也可以基于样品中优势物种作图;箭头射线：箭头分别代表不同的环境因子;夹角:环境因子之间的夹角为锐角时表达两个环境因子之间呈正有关关系,钝角时呈负有关关系。环境因子的射线越长,阐明该影响因子的影响限度越大； 不同颜色的点表达不同组别的样品或者同一组别不同步期的样品,图中的拉丁文代表物种名称,可以将关注的优势物种也纳入图中；环境因子数量要少于样本数量,同步在分析时，需要提供环境因子的数据,例如 p值，测定的温度值等。23. 有其她问题可以联系谷禾信息。END注意事项 假设您要对人体肠道微生物菌群进行测序，一般可以选择对粪便进行取样。一般建议采用新鲜样品，由于微生物自身是活的群体，样品长期保存或不在原环境下保存会变化原有菌群的构成，最后导致我们得到的菌群构成发生偏差。例如粪便样品如果度低温保存了一段时间，则其中部分耐低温的菌也许仍然在持续繁殖，这样最后样品的菌群会发生偏差。如果是送往公司测序也建议一方面对样品进行N提取后再寄送，由于原始样品的寄送过程也也许导致菌群变化。