几种测蛋白含量方法的比较

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1、蛋白质含量测定措施的比较及肽含量的测定(一） 蛋白质测定措施的比较(原理、优缺陷）蛋白质含量测定法,目前涉及定氮法、双缩脲法、福林酚法（owry法）和紫外吸取法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法敏捷度最高,比紫外吸取法敏捷120倍,比双缩脲法敏捷10倍以上。定氮法较复杂，但精确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其她措施的原则蛋白质。在选择措施时应当考虑:（1)实验测定规定的敏捷度和精确度；（）蛋白质的性质；(3)溶液中存在的干扰物质；（4）测定耗费时间。蛋白质含量测定法,目前涉及定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸取法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法敏捷度最高,比紫外吸

2、取法敏捷00倍,比双缩脲法敏捷100倍以上。定氮法较复杂，但精确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其她措施的原则蛋白质。在选择措施时应当考虑：（1）实验测定规定的敏捷度和精确度；（2）蛋白质的性质；（3)溶液中存在的干扰物质；（4)测定耗费时间。1微量凯氏定氮法（B 50095-)11原理 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的限度可计算得样品之氮含量。1.2操作措施 样品经前解决、炭化、消化、蒸馏、滴定等重要环节.3特点 精确度较高,合用于02 .0m氮，误差为 2%；操作复杂费时,整个过程

3、需要耗时81，试剂消耗量大。，测得成果为总氮含量,涉及蛋白氮和非蛋白氮含量;合用范畴广,几乎所有样品均可用此措施。2双缩脲比色法2.原理 双缩脲法是运用蛋白质的双缩脲反映而测定蛋白质含量的措施。因蛋白质具有两个以上的肽键，因此有双缩脲反映。在碱性溶液中蛋白质与C2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与原则蛋白质溶液同步反映,并于050nm测定，即可以通过原则蛋白质的原则曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。2.2操作措施 原则蛋白溶液或样液直接加双缩脲试剂反映30min，即可测定。先绘制原则曲线,再测定样品23特点

4、敏捷度低 120g , 200分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单一;测定成果与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关;敏捷度不高,约为1g，双缩脲法常用于需要迅速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。3 福林酚法（Lowry法）31原理 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物,在一定条件下，运用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作原则曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在nm有最大吸取峰。.2操作措施 测定依次加福林酚甲液、乙液后可见光度计50nm测定；先绘制原则曲线、再测定样品。.特点 试剂配制略麻烦,但试剂可长期保

5、存；测定敏捷度高,约5g，测定期间约460分钟，操作简便；操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化(测定成果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响）。4 紫外吸取法4.1原理 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环具有共轭双键,使蛋白质具有吸取紫外光的性质。吸取高峰在8nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在28nm的光吸取值与肽键含量成正比。运用一定波长下,蛋白质溶液的光吸取值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 2操作措施 直接上紫外分光光度计测定，需绘制原则曲线43特点 敏捷度5000mg, 10分钟完毕,操作十分简便,但成果受样品蛋

6、白品种影响大。5 考马斯亮蓝法1原理 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范畴内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在95n处光吸取的增长量得到与其结合的蛋白质量。2操作措施 直接加考马斯亮蓝试剂反映5min后即可测定;先绘制原则曲线,再测定样品。5.3特点 敏捷度高,约为5 (比Lory法敏捷4倍),测定期间515分钟，操作简便、迅速、干扰物质少、重线性好，但规定样品颜色为无色或浅色,敏捷度高。（二)蛋白含量的测定措施及环节1 微量凯氏定氮法(GB509.5-）.1 试剂 硫酸铜、硫酸钾、硫酸、%硼酸溶液、混合批示液（1份0.1%甲基红乙醇溶液与份.%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；或2份

7、0.1%甲基红乙醇溶液与份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合）、40%氢氧化钠溶液、0.1ol/盐酸原则溶液。 1. 仪器 消化架、吸量管、量筒、微量滴定装置、锥形瓶、容量瓶、定氮蒸馏装置1. 分析环节：13. 消化精密称取固体样品0.22g,半固态25,液体样品120m(约相称于300氮)于干燥干净的凯氏烧瓶,加入6g无水K2O4，0.2g SO4，0L H2SO4。瓶口放一小漏斗,先小火加热待泡沫停止后加大火(30400),直到溶液澄清透明,再继续加热.h1。冷却后加水定容10mL(多次冲洗，使样品溶液所有移入容量瓶)1.3.2 蒸馏将%硼酸溶液1m放入100mL三角瓶中（接受瓶），加入甲

8、基红混和批示剂3滴,此时为紫红色,将冷凝管尖端浸入液面下。蒸馏装置中的水蒸气发生器装水2/，加入数粒玻璃珠,加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。精确吸取2.0 mL 0.0 m 试样解决液由小玻杯注入反映室,以0 mL水洗涤小玻杯并使之流入反映室内,随后塞紧棒状玻塞。将100 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反映室，立即将玻塞盖紧,并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10 min 后移动蒸馏液接受瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1 min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接受瓶。1.3 滴定馏出液用原则

9、H溶液滴定,直到蓝绿色变为淡紫色。并将滴定成果用空白实验校正。1.3.计算:蛋白质(%）=(V-V2)C.01F10/m V10V1样品滴定期消耗的原则Hl溶液体积（m)V2空白滴定期消耗的原则C溶液体积（mL）C原则HCl溶液的摩尔浓度（ml/L).0140mL ol/L Cl相称于0.0140g氮F氮换算成蛋白质的系数，一般食物为62试样的质量(g) V3测定期吸取消化液的体积(mL)2双缩脲法2. 试剂（1)原则蛋白质溶液:用原则的结晶牛血清清蛋白（S)或原则酪蛋白，配制成10g/L的原则蛋白溶液,可用BS浓度1mg/ml的A80m为0.6来校正其纯度。如有需要，原则蛋白质还可预先用微量

10、凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度,再根据其纯度，称量配制成原则蛋白质溶液。牛血清清蛋白用HO或09% C配制,酪蛋白用005moLNaOH配制。()双缩脲试剂：称取1.0g硫酸铜（uSO.5H2O）和.0g酒石酸钾钠（KC4H4O6.4H2O）,用0L水溶解,在搅拌下加入30L 1 aOH溶液，用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀浮现,则需要重新配制。22器材可见光分光光度计、试管15支、旋涡混合器等。2.3 操作措施.1 原则曲线的测定：取7支试管,分别加入,0.2，.,0.6,0.8，1.0mL的10mg/mL原则蛋白质溶液,

11、用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充足摇匀后,在室温（205)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以蛋白质的含量为横坐标，光吸取值为纵坐标绘制原则曲线。图1 双缩脲法测定蛋白质原则曲线3 福林酚法（Lowr法)3.1试剂3.1试剂甲：50份与1份B混合,即为试剂甲A液：1 a2CO3，2 NaOH和0.25酒石酸钾钠 (NaC4H4O6.O)。溶解于50 mL蒸馏水中。B液:0.5g硫酸铜(CSO452O)溶解于100mL蒸馏水中。31 试剂乙：在2 L磨口回流瓶中,加入00g钨酸钠（NaWO42H2O)，25钼酸钠(N2MoO42

12、H2O)及700 L蒸馏水,再加5 mL85%磷酸，10 mL浓盐酸，充足混合，接上回流管,以小火回流1小时，回流结束时，加入150g 硫酸锂(Li2SO),0 mL蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再反复滴加液体溴的环节)。稀释至L，过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用原则NaOH滴定,酚酞作批示剂,然后合适稀释，约加水1倍,使最后的酸浓度为1mol/左右。3.1.3原则蛋白质溶液（250 g/mL）:精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水再定容。3.2 仪器可见光分光光度计、旋涡混合器、秒表、试管.3 分析环节3.3. 原则曲线的

13、测定：取7支大试管,分别加入0，0,0.2,04,06,0.8，1.毫升原则蛋白质溶液（浓度为25g/mL）。用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入m试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合,于室温(2025）放置10分钟。再逐管加入0.5 mL试剂乙,同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色限度削弱。然后在室温下放置0分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于75n处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出原则曲线。图2 福林酚法测定蛋白质原则曲线4 紫外吸取法.1分析环节411绘制原则曲线 取八只试管分别加入0 ml、05 l、1.0 l、1.5 ml、

14、20 ml、2.5 ml、3.0 m、4L的1g/m牛血清蛋白原则溶液,加水至4 L,在20nm条件下测定其吸光值图3 紫外法测定蛋白质原则曲线5 考马斯亮蓝法5.1试剂.11 m/m牛血清蛋白原则储藏液：精密称取0.1牛血清蛋白原则品用蒸馏水定容于100mL容量瓶。5.2 100mL牛血清蛋白原则工作液液:取0m牛血清蛋白原则储藏液加水定容至100mL5.1.3 考马斯亮蓝试剂：取0.g考马斯亮蓝G-250溶于50m 95%乙醇，加入00L质量浓度为0.8g/的磷酸，作为母液保存,使用时用水稀释到1000mL。5 仪器和设备试管、移液管、移液枪、可见分光光度计5.3 分析环节531 原则曲线的绘制取六只试管分别加入0 mL、0.1 mL、. mL、. m、.6 m、0.8 L的浓度为10g/mL牛血清清蛋白原则液，补充水到1.0 mL。然后每只试管加入5. L考马斯亮蓝2试剂,摇匀放置min,在紫外-可见分光光度计95m处测定吸光值。以A95吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的浓度（g/L）为横坐标绘制原则曲线。图考马斯亮蓝法测定蛋白质原则曲线