细菌内毒素检查法常见问题与探讨

《细菌内毒素检查法常见问题与探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌内毒素检查法常见问题与探讨（9页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、此文章来源: 细菌内毒素检查法常用问题与探讨 摘要: 目的总结归纳细菌内毒素检查法中的常用问题，措施 收集整顿工作中发现的问题,查阅国内外有关文献资料，对照分析应用状况并比较其差别。成果与结论:从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所波及到的问题，觉得在应用方面还需要进一步完善、规范。核心词:细菌内毒素检查法；问题Discusion f cmonisus n teBactail ntoxin Tet, BETZHOU u-Wen.( harmacoloy batry， Hubi Instiute of Dg Exaintion, Wua 4304）ABSTRT: OBJCTIVE to s

2、ummaiznd concludte cmmonpbems in the cteral edotoxins tst ETHDS collectig theractica prolesi woknd referrig ohe relatd aticsand normation， wempaed ad analyzd i dfeencs RESULTS ndCNCUSIO th rbes concening thebacrial andotoxnstestwre comrehnsiveynerlize n thereviw frm five aspets and te conlus showd t

3、hat h applicton o t bctialendooxins ttneeto efurthr enancd and stanadize.Key wor： Bctaril EndtoxinTest； prolems 细菌内毒素检查法（Bacail Endutoxin est,BT ）是近二十年来发展起来的用于检测药物及其中间品中内毒素污染的一种措施;作为家兔热原检查法的一种替代,已经十提成熟,美国药典迄今已为八百余种药物制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐渐增多,已增长到20种,并且在增补本中将继续增长收载数量,该措施相对家兔热原检查法而

4、言,有劳动强度低、快捷、经济、敏捷和易于原则化等长处，受到广大药物质检人员高度关注。药典在药典基本上在措施学、构造及细节上均进行了重大修订,使其更加规范、合理。 由于该措施自身是一复杂的酶促反映过程,实验环节比较多,每个品种的限值制定和实验过程中波及到的原则品、鲎试剂、检查用水及干扰因素等，均会给对实验成果导致不同限度的影响，如下是笔者近年来在药物检查过程中发现的较为常用的问题进行的汇总， 以期对实际工作具有参照价值。、原则及限值的制定一种品种的原则及限值制定的妥当与否,直接决定了对药物自身质量的评价规定,原则规定太高、限值过严，往往影响产品的合格率，太松则不能保证药物质量，危及临床用药安全。

5、为此，各国药典均提出了基本的制定原则,除特殊状况需要阐明外，一般注射剂均按人最大体热阈值和人临床每小时每公斤体重最大使用剂量的关系来拟定,即L=K/M(一般静脉给药的值为5Eug,为人每小时每公斤体重最大使用剂量）,而大输液(10-00ml） 的限值各国基本是一致的,无论是复方还是单方，均可按单位体积中所含内毒素的量来控制,（一般按 5E);看似简朴的问题，在执行中却常常浮现多种各样的问题。常用问题举例如下:.1应以重量（g)表达的错用体积（m）表达 注射用更昔洛韦钠，按公式计算,其限值应为10E/mg,但生产单位规定改为0.5Euml,且未提供任何制定理由,也未阐明稀释措施。使检查人员无法操

6、作。1 不按人临床用量计算，按热原剂量计算 精氨酸阿斯匹林,若按人临床用量计算其限值应为0./mg，但检查法制定中却按热原剂量计算为.03Eu/mg,严格了10倍,因浓度较高，浮现了干扰，给实验带来了麻烦。1.3随意放宽原则 有的新药研发单位对自己的产品没有信心,或按规定的限值不能过关(检查不合格或有干扰)，则将原则随意放宽，如：谷氨酰胺注射液，美国药典规定限值为0.5Eu/ml，研发单位自行改为“稀释6倍后,按0.5E/。”，放宽了6倍,且未阐明理由。4 照搬错误的原则 一品种限值根据其临床用量计算应为5Eumg，但已有暂行国标，限值为5Eu/g，厂家则规定改为7um,事实上第一种厂家所报原

7、则没有根据，但由于漏审或未经专业人员审查直接变成了国标,此类原则太松。无法控制质量。1.5 相似品种具有不同的国标在全国大输液抽样检查的50批样品中，细菌内毒素检查和热原检查原则较为混乱,有的采用家兔热原检查法,有的则是细菌内毒素检查法,且部分内毒素检查法同一品种限值却不同样。例如:克林霉素磷酸酯注射液，有的原则限值规定为0.5 E/mg,有的则为 u/g。16 随意修改,将对的的改为不对的某一注射用药物,某省所在进行措施学研究时,按临床用量计算后将限值定为60E /mg;申报单位在资料汇总时改为:“取本品,加水5l，再稀释8倍，每瓶含内毒素的量不得过100 Eu”。（本品规格为：1mg/支,

8、人用量m/次）。尽管修改后的原则较之修改前严格了，但对原则的修改没有提供任何支持的实验数据。此外，该原则尚存在三处明显的错误,其一是没有注明细菌内毒素检查用水，而是仅仅描述为加水。其二是没有规定具体的药物规格，只是描述为“每瓶含”，忽视了每瓶也许带来的规格问题。其三则是限度的规定尽量不使用类似“不得过”的描述,目前更精确的描述多采用“应不不小于”17 检查措施表述不清晰紫杉醇注射液:“取本品,加细菌内毒素检查用水至少稀释40倍后，依法检查(附录E),每l中含内毒素的量应不不小于2.4u”;此类表述很容易引起理解上的错误,是原液中的限值为2.E ,还是稀释后每ml中应不不小于.E？无经验的操作人

9、员往往会觉得是后者。此类问题，全国药理室主任会及版内毒素品种扩大会议已有统一意见，不倡导如此写法,因不同厂家、不同工艺生产的同一品种样品往往干扰限度不一致,稀释倍数就不一定相似(特别是中草药注射剂）。8在药典原则中浮现原料药与制剂限值不一致, 阿米卡星（制剂）0.3Eu/m,原料2.2Eu/g，前者是计算值，后者如何得来，不得而知。（已将后者勘误纠正为033 E/mg）19 用灭菌注射用水替代细菌内毒素检查用水 某质量原则记述为:“取本品,加灭菌注射用水1ml溶解后，依法检查.”。此类原则往往是按阐明书上临床用法照搬而来的。2、检查措施及干扰实验1样品检查 在对样品进行检查时,由于研发单位对检

10、查人员的专业技术培训不够，使得操作者对原则及操作中的基本概念辨别不清,理解有误。例如：2110ml/支装量与敏捷度0.E /m的鲎试剂,0.5u与0.5EUmg限值的概念不清。.1. 2配制样品溶液时，在理解限值(）与鲎试剂敏捷度 ( ) 的关系问题上概念模糊，如：青霉素限值为0.01Eu/00u；有的顾客就觉得一定要0.1Eu/ml敏捷度的鲎试剂；又如甲硝唑注射液，过去的原则限值0.5Eum，就规定买0.35u/m敏捷度的鲎试剂。2.1.3不管品种性质与否适合将家兔热原检查法改为内毒素检查法,从而导致了原则上的不统一和成果的不一致。如：中草药注射剂，某些新生物制品，某些医疗器材等,它们导致的

11、发热也许不仅仅是内毒素，也许尚有多糖核苷酸,高分子抗原或半抗原等非内毒素热原,细菌内毒素检查不能检测出该类物质，一味地将此类产品改为ET，在临床上也许就存在热原反映的隐患。2.2干扰实验 在对某一品种建立细菌内毒素检查法的过程中，干扰实验是十分重要的环节，只有证明该品种不存在干扰或清除了干扰，才干用于平常的检查。干扰的类型重要体现为克制干扰和增强干扰。诸多实验室的经验表白绝大部分的干扰因素来自于样品，如:不同来源的原料、生产工艺的变化，导致样品的PH、样品的成分、样品的浓度等变化。因此,虽然来自不同厂家的同一品种,其生产质量也不尽相似,因此应当规定每个生产厂家在报批时均应提供有关措施学的研究报

12、告。表目前措施学验证及样品最大无干扰浓度上的问题重要有：2.2. 1 觉得国内或国外已有生产的品种，措施学验证就可以不做。导致大量的新药原则特别是仿制药未做系统的干扰实验。22. 2 觉得一定要按最大有效稀释倍数（Maxmum ali iltion VD)或最小有效浓度（Minimumalid concentainVC)进行实验。事实上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的反映,这种状况下，只要样品内毒素含量合格，可以在M范畴之内,即不不小于MVD的倍数下进行实验,如果一种样品在不不小于MVD的状况下实验时样品阳性管有干扰,或样品管为阳性,可再按MV进行相相应的稀释重新实验.3、与国外原则

13、的差别31单次实验鲎试剂的加样鲎试剂的规格分单次实验瓶(STV)及多次实验瓶（TV)两类。目前世界上除中国外其他国家ST的使用都是直接加0.2ml样品溶液复溶试剂兼检查。中国药典对S规定是先加0.1ml ET水复溶，再加0样品溶液作检查。3.2.工作原则品的效价标定 内毒素工作原则品（CE)的效价标定有两种措施，一种是浮动效价标示法,另一种是固定效价标示法。浮动效价标示法对每批号E只标示它的含量（重量，如mg, 等)，当这批号S拟定配那一批鲎试剂使用时,鲎试剂厂家才向顾客提供一份效价测定证书(Certificatof nalyss, oA),给出使用该批号鲎试剂测定的RS/CS比率以及该批号S

14、E的效价。固定效价标示法是以某一批（或数批）鲎试剂测定该批SE的R/S比率，从而计算出该批E的效价。例如,某批鲎试剂对某批CSE的RSECE比率是8Eug，该批CSE的装量是10 ng/支，则S的效价就是8u/ng10ng/支=8E/支,以此作为该批CE的标示效价。目前欧美国家采用的是浮动效价标示法,国内采用的是固定效价标示法。以上两种效价标示措施均有所长和局限性，其应用背景也不尽相似。严格说来,中国的工作原则品和美国的工作原则品在定义上不完全一致，中国药典对内毒素工作原则品的定义是：系以细菌内毒素国标品为基准标定其效价,用于实验中鲎试剂敏捷度复核、干扰实验和设立的多种阳性对照。美国内毒素工作

15、原则品最初的使用是源于国标品的费用较高和对国标品的潜在消耗,建立工作品的重要目的是作为国标品的替代品，用于平常内毒素检测工作的,由于美国实行鲎试剂批批检制度,因此工作品不用于鲎试剂敏捷度的复核,重要是用于设立多种阳性对照（阳性对照和供试品阳性对照）和确证试剂、实验材料和操作措施的可行性；FA对工作品不进行控制，由生产厂家自行生产和管理。 在国内,现阶段对鲎试剂的敏捷度没有进行批批检定,鲎试剂的出厂检查始终是由厂家自行按部颁原则进行;由于各鲎试剂厂家之间的生产条件、工艺技术水平还存在一定差别,很难保证每一批鲎试剂的敏捷度都符合原则,为此规定顾客在使用前用统一的工作品复核敏捷度;应当说，中国的工作

16、原则品除了有“工作”的含义外,尚有一定意义上的“监控”作用。基于此,就现阶段来说,我们还无法评价国内外这种标定差别上的利与弊，盼望此后能在不断的实践过程中，能找出更为有效的、合理的措施。3.3 对供试品溶液pH规定中国药典ET法对供试品溶液的H值规定在608的范畴内。但事实上，有许多样品溶液的pH值不在此范畴内也对ET不导致干扰,因素是鲎试剂自身有缓冲能力。事实上，应当这样觉得：一种供试品与否要调节pH值,应根据干扰实验的成果来判断。如果该供试品对BET有干扰,且干扰的因素是由pH值不合适导致的,才有必要调节供试品的p值。美国药典BET法对供试品溶液p的规定是:测定供试品溶液与鲎试剂溶液的等体

17、积混合液的p值,应在6.08.范畴内。这意味着当供试品溶液的p值的影响超过了鲎试剂的缓冲能力时,才需要去调节供试品的p。4、有关细菌内毒素检查用水 药典规定凝胶法用细菌内毒素检查用水内毒素的量应不不小于.15/ml ,对使用敏捷度为0.Eu/ml的鲎试剂没有多大问题，但如果用0.03Eum的鲎试剂则也许存在问题。如果实验成果为阳性,则应谨慎考虑。5 、其他、1不适宜建立BE的品种 根据本实验室经验 :511中草药注射剂,由于中药成分复杂、干扰因素多、同一品种样品往往干扰限度不一致，且阳性率偏高；如炎琥宁,复方丹参注射液、红花注射液、紫杉醇注射液等。5.1.2部分生物制剂及钙镁离子鳌合剂,酶克制

18、剂等52需要解决的品种1 不合适的H条件，如样品的 H值偏高或偏低，可用碱性或酸性缓冲液来调节至合适的p值范畴,或采用高敏捷度鲎试剂进行相应稀释后来解决。浓度较高的氨基酸品种及部分抗生素品种均可通过通过以上措施来解决干扰。5.2.2 由于鲎试剂中促使凝胶形成的丝氨酸蛋白酶可以被多种化学物质变性失活（如醇、酚、抗癌药物等)，如果导致鲎试剂变化的药物是蛋白酶类，可用7加热10分钟左右热解决后再稀释，或者使用超过滤的措施。5.2.3 对钙镁离子有鳌合伙用的品种,可使用含钙镁离子的溶液来稀释样品。以上方式均需进行措施验证，以证明对添加内毒素回收不存在克制或增强,可以通过与水中对照内毒素的回收进行比较得

19、以验证。5.3 建立BT 应注意的事项5.3.1 大输液品种限值一般定为.Eu/ml., 小剂量注射剂及冻干剂限值按人临床用每小时每公斤体重最大给药剂量计算，同步应考虑联合用药及给药途径,推注、静注应从严把握,必要时，对L值应作相应调节。单纯的肌肉给药且用量不大的品种可以不建立E。3.限值单位表述措施应对的、规范；注射用、冻干剂一般以主药含量计算,以Eu/m表达;不适宜用Eu/每瓶表达。小剂量注射液用Eu/mg或Euml均可;大剂量注射液一般用Eu/ml表达。5.3. 3所有稀释用水均应为细菌内毒素检查用水,由于注射用水和其他去离子水中内毒素及其他因素控制规定较低，会影响细菌内毒素的检查。5.34原则的制定应有根据，应有起草阐明. 不仅仅新药,仿制药也应做措施学研究;由于不同的工艺生产的样品往往质量不同样;建议使用三批不同步间生产的样品,用2个以上厂家生产的鲎试剂进行措施学研究、以考察制剂工艺的稳定性。（该文章正式刊登在中国药学杂志期-作者：zsw,l) E-MAIL：SW6660163C