实验一-蛋白质的沉淀与凝固

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1、实验内容实验一 蛋白质的沉淀与凝固 蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液,其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之互相排斥，不易凝集成团;二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏,蛋白质将于溶液中沉淀析出。 促使蛋白质沉淀的因素诸多,大体可分为两类:第一类是可逆的沉淀反映。这时蛋白质的空间构象未受到很大变化,除去沉淀因素后,可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反映,重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质构造发生重大变化，因此不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表达蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电

2、点附近加热时,蛋白质分子间互相盘绕而变成坚实的凝块。一、 蛋白质的盐析 原理高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜,同步盐又是强电解质，可克制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少,水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离多种天然蛋白质。由于蛋白质的构成及性质不同，因此盐析时所需中性盐的浓度也不相似。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白,饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。 操作 1取一试管，加入3ml5蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液,摇匀静止数分钟后观测现象。 2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态,摇匀后观测现象。（注意固体硫酸铵若加到过

3、饱和则有结晶析出,勿与蛋白质沉淀混淆。) 3.取上项浑浊液1ml,加水2ml，观测与否复容。二 乙醇沉淀蛋白质 原理乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小,蛋白质解离度减少,带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性,但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性,形成不可逆的沉淀。 操作1. 取试管支,标出1、3、4号码,按下表操作试剂 125蛋白质溶液（l）111-乙酸(滴）-2-5%乙醇（ml)- 2将3管及4管置冰水中，放置5分钟,然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中(此步最佳在冰水

4、中进行)，混匀,同步向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2m混匀，观测各管的沉淀状况并立即向第1、及3管中各加入蒸馏水10m，混匀，比较各管变化并解释之。三 重金属盐沉淀蛋白 原理 在溶液的PH值不小于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（a2+、H2、A1+、Pb等）结合成盐而沉淀。 操作 取试管4支，按下表操作。试剂 （滴)1234%蛋白质溶液5551乙酸 -101010/硫酸铜3-30/L硝酸银3-3混合均匀,比较各管浑浊限度并解释之。四. 生物碱试剂沉淀蛋白 原理能沉淀生物碱(或植物碱）或与其产生颜色反映的物质称为生物碱试剂,如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。在溶液的PH值不不小于蛋白

5、质的等电点时,带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。 操作 取试管支,按下表操作。试 剂 135%蛋白质溶液（m)1111%乙酸（滴)01苦味酸溶液(滴）数滴-鞣酸溶液（滴)数滴-三氯乙酸溶液（滴）-数滴混合均匀,比较各管浑浊限度并解释之。五. 蛋白质的加热凝固原理 蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固,在加热过程中,随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有诸多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。 操作取试管4支，按下表操作试 剂3%蛋白质溶液()2221乙酸(滴）-12-0

6、%乙酸（m）-.5-100g/LNaOH(ml）-05混匀后各管分别加热，观测有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。此外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观测与否复溶，为什麽? 试剂 1%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍,搅匀后用纱布过滤。 2饱和硫酸铵溶液。 3硫酸铵结晶粉末。 4.95乙醇。 51%乙酸和10%乙酸。 63/L硝酸银溶液。 .1g/L硫酸铜溶液。 .10g/L氢氧化钠溶液。 9苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。 10.10g/L三氯乙酸溶液。 （李素婷) 实验三 微量凯氏定氮法 原理蛋白质样品与浓硫酸共热时,分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨,氨与硫酸结合生

7、成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与原则液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白,可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.5即得蛋白质量。 操作取血清或血浆0.ml，以.9%NaCl溶液稀释至1l（稀释50倍）2.取消化管1支，加入稀释血清.m,0%硫酸0.ml， 玻璃珠1枚,在电炉上消化。当浮现白雾并布满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化分钟左右,冷却，加3H2O12滴,再消化至浮现白雾,加盖,继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5l,再加纳氏试剂至5,混匀,与原则管比色。4原则管制备：取硫酸铵原则液(应用液）制备原则曲线,以蒸馏水作空白调零,500nm波长比色。5.原则曲线制备：取硫酸铵原则液

8、（应用液)制备原则曲线，取5支干净试管操作如下试 剂（ml)2345原则硫酸铵应用液0.81.21.62.018N H201.0.100蒸馏水3.4.6.21.81混匀,各管加奈氏试剂15 ml， 以第1管为空白,用50n波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一原则曲线。6测得测定管的光密度值,于原则曲线上查出含氮量。计算 蛋白质%含氮量6.2500 试剂1.50硫酸2. 18N硫酸溶液：取比重.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。3. 3%H22. 0.NaC5 奈氏试剂： 奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水

9、100毫升和纯汞15克,振摇到碘色将变时（约15分钟)，混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物多次,将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至毫升。奈氏试剂应用液：取1%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液15毫升，摇匀,用蒸馏水稀释到000毫升。如浑浊,可静止过夜,取上请液备用。6.硫酸胺原则贮存液:(1毫升1毫克氮） 取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时,取出置干燥器内待其冷却,精确称取干燥的硫酸铵.76克,置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解,加纯浓硫酸1毫升,再加蒸馏水

10、至刻度。(NH)S4分子量132.06；其氮占28。 故:1320628=.16X X即4.71克硫酸铵中含氮1克 .硫酸铵原则应用液: 取硫酸铵原则贮存液1.0毫升,于100毫升容量瓶中，加纯硫酸01毫升，以蒸馏水稀释至刻度,于带磨口玻璃瓶中保存。(周晓慧)实验四 双缩尿法测定蛋白质含量 原理凡具有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反映称为双缩尿反映。蛋白质具有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反映,且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,经与同样解决的原则蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。 操作 1原则曲线的制备 取6支试管按下表配成不同

11、浓度的原则蛋白液试 剂23456原则蛋白溶液（10mgl)0.001.3.507.9生理盐水（ml)10097.50.1双缩脲试剂（)4.0404.04.0404.蛋白浓度(mgml）0.00.0.601.18混匀后,于37水浴中保温15分钟,在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制原则曲线。 2.样品测定取待测蛋白样品0.ml，加生理盐水.9,再加双缩脲试剂4.0ml，于水浴中保温1分钟，测其光密度，查原则曲线即可得出样品中的蛋白质含量。 试剂 110g/L原则蛋白溶液：精确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白0

12、g,用生理盐水配成浓度为0g l。 双缩尿试剂：称取CuSO45H2O 2.5g、蒸馏水100l加热助溶。另取酒石酸钾钠1g、碘化钾5g,溶于500毫升蒸馏水中，再加200 /L NOH 30ml混合,然后将硫酸铜溶液倾入,加蒸馏水至1000 m。 3.生理盐水（周晓慧）实验五 改良酚试剂法测定蛋白质含量 原理蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。运用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制原则曲线，测定样品中蛋白质含量。 操作 (一）制作原则曲线 1取试管6支分别编号,按下表加入试剂： 试 剂(ml)123456

13、原则蛋白溶液(1/ml)0.0.60.8.0生理盐水1.0.80.6040.200试剂A0.900.9 混匀后置于5C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B .l，室温放置1分钟，各管加入试剂C3ml,立即混匀，置37C水浴箱恒温1分钟。冷却后以1号管为空白,在分光光度计上以波长0n比色,读取光密度值。 2.以各原则样品蛋白质浓度为横坐标,各管光密度值为纵坐标作原则曲线。（二)样品测定 取试管2支，按下表加入试剂试 剂(ml）测定管空白管稀释的待测样品1.-生理盐水-10试剂A0.99混匀后在5C水浴箱中保温1分钟,取出冷却后，两管各加试剂B 0.1l，室温放置10分钟,再各加试剂C l，立即混匀

14、，置7水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。 成果与计算根据测定管光密度值查原则曲线,由原则曲线计算样品蛋白质含量。注意事项 1.测定蛋白质的浓度应在.050110g/l范畴。 2.各管加酚试剂必须迅速,并立即摇匀,不应浮现混浊。试剂 1.原则蛋白溶液:称量干燥的人血清白蛋白(SA)或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mm的原则蛋白溶液。 2.试剂：g酒石酸钾钠及10g Na2CO溶于500lml/L aOH中,用蒸馏水稀至100ml。 3.试剂B:g酒石酸钾钠及1g CuSO4分别溶解于少量水中,混合后加蒸馏水至90,再加1ml1mol/L NO即成。

15、 4.试剂C: （1）市售的酚试剂，用1mlL NaOH滴定相称于2.5 molCl，按10稀释即可。 （2)称取aWO42H2 100g及a2Mo422 25g溶于700ml蒸馏水中，加入85% H3PO4 50ml，浓H00ml混匀后,置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（i2SO2）5、蒸馏水50l及浓溴水数滴,继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存,使用时稀释至1mol/L。（周晓慧)实验六 紫外分光光度法测定蛋白质含量 原理 蛋白质在80nm处的特性性吸取峰，是由于其中所具有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白

16、质的浓度呈线性关系,可用于蛋白质的定量。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同,其光密度值也不同,选用原则蛋白质时必须注意。若样品中具有其他具有紫外吸取的杂质,如核酸、核苷酸等,可产生较大的误差，故应作合适的校正。蛋白质样品中具有核酸时，混杂的核酸在80处也有吸取,对此法有一定的影响。因此，一般状况下在测定A280的同步,测定A260，计算A28/260 的比值。如果A280/A01.5，可忽视不计核酸的影响,28/A2601.时，需按下列公式计算蛋白质的浓度: 蛋白质浓度（m/ml）=1.55A280-.7A0 操作 .原则曲线的制备: 取试管支按下表加入试剂试 剂(

17、l)34567原则蛋白液（1mg/l）0.0.5001.0001.52.0002.503.040000.%l溶液4.03.503.000252.0005001.0000蛋白浓度(g/ml)0.00.1250.250.500.25.750.000混匀,选波长20,用1cm石英比色杯，第一管为空白,分别测定各管溶液光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标,绘制原则曲线。 2样品测定：将待测的蛋白样品用0.9%NaC溶液稀释，使其浓度在蛋白原则曲线范畴之内，混匀后按上述措施测定光密度值，查原则曲线,得出样品的蛋白浓度。 试剂 1.原则蛋白液:精确称取结晶牛血清白蛋白(精确0.001)用0.9%

18、 aCl溶液配备成1g/ml的溶液(需用凯氏定氮法校正）。 2 0.9% Nl溶液。(周晓慧）实验七 凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜 原理血红蛋白（分子量64500)与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂,进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。操作1凝胶的准备:葡聚糖凝胶-2 1,置于锥形瓶中，加蒸馏水3ml,于沸水浴中煮沸2小时（或在室温放置小时），待冷却至室温时装柱。2装柱：在层析管底部填少量玻璃棉,关闭玻管的出口。然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-2悬液。待底部凝胶沉积1cm时,打开出口。当凝胶上升至距柱顶3m时即可。.样品的制备:() 血红蛋白的制备：取草酸

19、钾抗凝血ml于离心管中,300转分离心 分钟,弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。将血细胞用倍体积蒸馏水稀释。（2)铜溶液的制备:将硫酸铜73溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15m。另取柠檬酸钠1.3g及碳酸钠(Na2C3H2O）g，加水0ml,加热使之溶解，冷却后稀释到85l。之后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：3体积混合，作为样品。4.加样:（1)将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出,直到床面正好露出,再关闭出口。(2)用小滴管将样品(约0.8m)沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内,直到床面重新露出。（3）用上

20、述措施加入约2m蒸馏水。当将近流干时,反复加入多量蒸馏水,进行洗脱,直至红蓝两条带分开为止。试剂1 葡聚糖凝胶G-2。2 草酸钾。3 生理盐水。4 硫酸铜。5 柠檬酸钠。6 碳酸钠。(王鲁华）实验八 凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白原理本实验使用交联葡聚糖凝胶(Sphadex-0）将血红蛋白(红色，分子量为6450）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。由于它们的分子量及颜色的不同,可以观测到血红蛋白洗脱较快,而鱼精蛋白洗脱较慢。操作1.凝胶的制备称取Sepdex -0 ,置于锥形瓶中，加蒸馏水3ml，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀,如在室温溶胀，需浸泡小时），取出冷却至室温后再行装

21、柱。2装柱取直径0.81c,长度70cm的层析管，在底部填砂芯或少量玻璃棉,装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管,垂直置于铁架上,柱中先加入少量水，布满细玻璃管，并残留部分水于层析管下部,以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。然后关闭玻管的出口,边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积2c时,再打开出口，一面继续加凝胶,待凝胶上升至距玻管顶3c左右即可停止，最后以蒸馏水平衡凝胶柱。加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉,以免层析床分层,同步避免柱内有气泡。如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。3样品的制备（)血红蛋

22、白（H)溶液的制备:取草酸钾抗凝血ml于离心管中,以250r/in离心分钟，弃去上层血浆，用.NaCl5l洗血细胞,反复三次，每次要把血球搅起，以3500r/in离心分钟后尽量弃去上清液。加蒸馏水5ml,充足混匀，放冰箱过夜使沉淀的血球充足溶血,备用。(2)DP-鱼精蛋白的制备：称取鱼精蛋白0.15g，溶于0%NaHC3溶液1.5m中（此时该蛋白质溶液p应在8.5.0左右)。另取二硝基氟苯0.15g,溶于微热的95%乙醇3ml中，待其充足溶解后,立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中,煮沸5分钟,冷却后加2倍体积的5%乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心5分钟，弃去上清液,沉淀用5

23、%乙醇洗2次，所得沉淀用1l蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。()取血红蛋白稀释液0.m,加P-鱼精蛋白溶液0.2ml，充足混匀，此混合液即为样品溶液。4加样加样时先将层析管出口打开,使床表面蒸馏水流出,直到床面正好露出,用下口较大的滴管，将上述样品（约.3ml）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽量不使床面搅动,然后打开出口,使样品进入床内,直到床面重新露出，反复上法加12倍于样品体积的蒸馏水，这样可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。当少量蒸馏水将近流干时,加入蒸馏水使其布满层析柱上面空间,开始洗脱。5.洗脱与收集反复加入蒸馏水洗脱,调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在.51.

24、l分左右（约105滴分)洗脱时可观测到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带达到玻管下端时,用带刻度的离心管收集流出液，直至红色液所有流出为止，待测。再换以另一离心管,收集黄色的D-鱼精蛋白洗脱液,直至黄色液所有洗出为止,此液可回收重新使用。成果与计算取一试管吸取前述血红蛋白液.1m，加蒸馏水至5ml作为原则管（上柱前液）,取收集的血红蛋白液加蒸馏水至5。以蒸馏水为对照,测得原则管及收集管液体在4nm波长处的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。血红蛋白回收率(）=洗脱收集液光密度值上柱前液光密度值 10试剂1 Sephadex G-502 草酸钾抗凝血液3 0.9NaCl4 鱼精蛋

25、白5 %NaHCO36 2,-二硝基氟苯7 %乙醇(王鲁华）实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 原理 血浆中的多种蛋白质，它们的等电点都在pH7.如下,如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时,它们都解离成负离子,向正极移动。在同一H溶液中,由于多种蛋白质所带电荷的数量不同以及分子大小不同,因此它们在电场中的移动速度也有差别，运用这种性质可以把多种蛋白质分开。 醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快,区带清晰、操作简便等长处。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白-球蛋白等条区带。固定染色之后,不仅可看到清晰的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定

26、,从而计算出血清中多种蛋白质的构成比。 操作 1.准备与点样: （1)将薄膜切成2c的小条，在薄膜无光泽面距端1.5cm处用铅笔画一横线,表达点样位置。 （2)将薄膜无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液中(缓冲液盛于培养皿中)。 （)将充足渗入(指膜上没有白色斑痕)的膜条取出,用滤纸吸去多余的缓冲液,把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线驾空。 (）吸取少量血清滴于一般玻璃板上,用光片或加样器的钢口蘸取样品,平直印于膜上,待血清所有渗入膜内,移开点样器。 .电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极。槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧,待平衡5分钟后通电,调节

27、电压至90V，或电流为.4.6mA/m宽,通电1小时左右关闭电源。 3.染色:通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中,染5分钟取出，一方面用自来水冲洗一下,然后立即浸入盛有漂洗液的培养皿中,反复漂洗多次,直至背景变白为止。用滤纸吸干薄膜。 4.定量：（1）取试管支，编好号码,分别加入0.ol/氢氧化钠ml。(2)剪开薄膜上各条蛋白色带,另于空白部位剪平均六小的薄牵，分别浸入上述试管内,不时摇动,使蓝色洗出。（3）约半小时后,用分光光度计进行比色,在0nm波长下读取各管的光密度,用空白薄膜条洗出液为空白对照。 计算 光密度总和T=A+ 各部分蛋白质的构成比为： 白蛋白A/

28、T;1球蛋白=1/T：依次类推。 临床意义 1 正常值:白蛋白为0.540.;球蛋白为040.0；2球蛋白为0.070.9;球蛋白为0.013;球蛋白为0.10.222 肝硬化时，白蛋白明显减少，球蛋白升高3倍。肾病综合征时，白蛋白减少,2、球蛋白升高。 试剂 1巴比妥缓冲液(pH8.6）：巴比妥钠1276g、巴比妥1.6g、蒸馏水加热溶解后再加水至0m（离子强度0.06)。 2，氨基黑10染色液：氨基黑1B 0.g、甲醇 ml、冰醋酸1 ml、蒸馏水0l。 3.漂洗液:5%乙醇45 l、冰醋酸5 m、蒸馏水0 ml。 40.4mo/L NaH。(王文勇)实验十一 血清球蛋白的分离、纯化及鉴定

29、 原理 为了研究蛋白质的性质、构造及功能，一方面要从大分子体系中分离纯化这种蛋白质，并且须保持天然蛋白质原有的构造与生物学活性(即不变性)是比较复杂的,蛋白质分离重要是运用多种蛋白质性质的不同，特别是蛋白质在不同酸、碱环境中的性质和电学性质的差别。分离蛋白质常用的措施有：盐析、层析、超离心、超过滤等，根据目的规定不同，可分别采用这些措施或几种措施配合使用。本实验以分离纯化血清-球蛋白为例,简介一种蛋白质的分离纯化措施。过程涉及：盐析、离心分离、凝胶层析、离子互换层析纯化、浓缩和电泳鉴定等几种环节。 (一）盐析法粗提蛋白质 血清中具有清蛋白和球蛋白（a- b- g 、球蛋白）,由于它们所带电荷不

30、同，分子量不同,在高浓度盐溶液中溶解度不同，因此,可运用它们在中性盐溶液中(常用硫酸铵、硫酸钠等）溶解度的差别而进行沉淀分离，此法称为盐析法。由于多种蛋白质分子的颗粒大小和亲水限度不同,故盐析所需的盐浓度不一，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀析出,达到分离目的。 本实验采用在血清中加入50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解于溶液中，经离心分离获得沉淀部分，即为具有g-球蛋白的粗制品。 （二）凝胶过滤层析法脱盐用盐析法分离而得到的蛋白质中具有大量的中性盐,会阻碍蛋白质的进一步纯化，因此必须一方面清除。常用的措施有透析法、凝胶过滤层析法等。凝胶过滤层析法重要根据混合物中分子大小不同

31、的多种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时,多种物质分子扩散移动速度不同使混合物中多种物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶(Sepad)是常用的一种人工合成的凝胶,脱盐用sepadxG25层析柱,它的骨架是-1，6-糖苷键联接成的直链葡聚糖,由环氧氯丙烷作交联剂制成的多孔网状构造的多聚物。成果大分子物质（蛋白质）直径大,不能进入凝胶颗粒的网孔中,垂直向下移动,速度快。而小分子物质(无机盐）可扩散入凝胶颗粒网孔中，流经的路程长、速度慢，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，蛋白质先流出，无机盐后流出，得到除去盐的蛋白质溶液 (三)离子互换层析纯化蛋白质纯化蛋白质的措施诸多,如

32、多种层析措施:离子互换层析、凝胶层析、吸附层析及亲和层析等;多种电泳措施：可选用制备区带电泳、等电聚焦电泳及蛋白质结晶等。本实验采用EAE-纤维素二乙基氨乙基,-H2-CH2-+H（CH-CH3)2离子互换层析法进一步纯化g-球蛋白。蛋白质是两性电解质,本实验所调节的溶液pH为6.5，此时溶液中的清蛋白.7、球蛋白pI 5.6、-球蛋白p 512皆带负电荷,而r球蛋白pI 7.带正电荷。DEE-纤维素是一种阴离子互换树脂，自身带有正电荷，可与溶液中带负电荷的离子结合,如-球蛋白、球蛋白等。而带正电荷的r球蛋白则不能结合在树脂上,因而在洗脱的溶液中只留有r-球蛋白,以达到纯化的目的。 （四）浓缩

33、干燥的葡聚糖凝胶颗粒内部有孔隙容积。当把干燥的葡聚糖凝胶颗粒投入稀的高分子溶液中时水分和低分子量物质就会进入凝胶颗粒内部的孔隙直到布满为止,而高分子物质则排阻于凝胶颗粒之外，因此，经十几分钟后通过离心或过滤就可分离出膨胀的凝胶颗粒,得到浓缩了的高分子溶液。 运用葡聚糖凝胶G-2型干胶吸水膨胀，而不吸入蛋白质的特性，在已纯化的-球蛋白溶液中加入适量葡聚糖凝胶G-25型干胶。离心约5分钟（3000转/分)。上清液即为浓缩的球蛋白溶液。（五)电泳法鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法)运用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物，将未分离纯化的原血清样品点样于膜上进行电泳时,可将血清蛋白分为清蛋白、1、2、 及球蛋白等条

34、区带，而用分离纯化后的-球蛋白溶液点样电泳，在球蛋白相应位置仅呈现1条区带（电泳迁移率相似),将区带洗脱，或直接扫描，可计算出多种蛋白质的百分含量。 操作(一)盐析粗提：取正常人血清2.0ml于小试管中,边摇边缓慢加入饱和硫酸铵溶液.0ml,使之成为半饱和溶液。混匀后室温放置10分钟，3000转/分，离心10分钟，弃去具有清蛋白的上清液。于沉淀中加蒸馏水.0ml,振摇使之溶解，此液即为粗提的球蛋白溶液。(二）脱盐:1凝胶解决：（教师准备)，称取葡聚糖凝胶G-5型60g于小烧杯中，加100ml蒸馏水，置沸水浴1小时,并以玻璃棒轻轻搅动以使气泡逸出。冷却置室温，待凝胶大部下沉后,弃去具有细微悬浮凝

35、胶颗粒的上清液。加蒸馏水约100ml轻轻搅动半晌,再弃去具有细微颗粒的上清液。加.0ol/L 6.5醋酸铵溶液00m。轻搅拌半晌，待大部分凝胶下沉后,弃去具有细微颗粒的上清液，再加醋酸铵溶液00l反复解决一次，最后加入醋酸铵溶液2ml，此即为已溶胀备用的凝胶溶液。2.装柱：取一层析管（.50cm 或2ml碱式滴定管)，垂直夹于铁架台上,关闭玻管出口,先加入醋酸铵溶液约0ml,打开出口让硫酸铵溶液布满下部容器然后排出,以排除空气。关闭出口,自玻管顶部缓慢加入溶胀后的葡聚糖凝胶混悬液，边加边搅拌,保持凝胶均匀持续地沉降，当混悬液达玻管顶部时,打开出口,以螺旋夹控制流速10-滴/分，继续加混悬液，待

36、凝胶面上升至距玻管顶口cm左右时即可停止,柱床面留一层液体。3平衡：用螺旋夹控制流速8-10滴/分,用醋酸铵溶液（ pH6.5)流洗平衡几分钟后，即可使用。凝胶管柱上端平衡液始终不少于1c高度，不得浮现干胶和断层,并应保持凝胶面平整。4.上样:即样品上柱,待层析液（醋酸铵溶液 H 6.）上端的液面刚好下降至凝胶表面时(切勿进入空气)将凝胶层析管下端的螺旋夹拧紧,这时将盐析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入层析柱内,打开螺旋夹,用试管收集流出的液体,当球蛋白溶液正好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用ml醋酸铵溶液小心冲洗管壁上的蛋白质,然后再反复冲洗一次。5.洗脱：反复加入多量醋酸铵溶液进行洗脱,洗脱

37、速度为1滴分，每当试管内收集到1m(约15滴)液体时，应取1滴置磁反映板上加入0g/L磺基水杨酸试剂检查有无蛋白质流出,如有则呈白色混浊。每收集1ml换一试管，并不断检查蛋白质,直到反映呈阴性为止。再分别从每个试管各取出1滴蛋白液置磁反映板上加入50gL醋酸钡,直至检查浮现白色的aS4沉淀为止，将含蛋白质而无硫酸铵的溶液合并，此即为已脱盐的球蛋白溶液，待进一步纯化。6.凝胶的再生与保存：葡聚糖凝胶可柱内再生，故凝胶层析柱可反复使用，每次用完后以醋酸铵溶液进行充足洗涤，留待再用。为避免凝胶霉变，可用含02叠氮化钠的醋酸铵溶液进行流洗后再放置。长时间不用，宜将凝胶从柱内倒出,以湿态保存，只要在其中

38、加合适的抑菌剂如0.02叠氮化钠置4o冰箱内，可放置几种月至一年，不需要干燥。如凝胶柱有轻微污染，则可用0.2mol/LNaOH和0.5m/aC的混合液解决。（三)纯化 1.DE-纤维素解决：称取A-纤维素3.0，加0moL盐酸溶液45m,搅拌后放置30分钟，加蒸馏水250m，搅匀,待纤维素大部分下沉后,弃去具有细微颗粒的上层液体,如此反复2-次,用蒸馏水洗至流出液p4.0，再加05l/氢氧化钠溶液5l，搅拌后放置3分钟，弃取上层液体,再用蒸馏水洗至p70,弃上层液体后加醋酸铵溶液约00ml,用1mol/L的醋酸调至pH6.5(约5ml)，留待装柱。 .装柱：与葡聚糖凝胶层析装柱法相似。 3.

39、平衡：用p6.5醋酸铵溶液、平衡的措施、时间同葡聚糖凝胶层析。 4.上样：将脱盐收集的球蛋白溶液上柱,措施过程与脱盐法相似。 5.洗脱：用H 6.5醋酸铵溶液反复加入多量进行洗脱,流速20-0滴/分,措施与上述脱盐法相似，同样用20L磺基水杨酸检查有无蛋白流出。本次收集的即为纯化的-球蛋白溶液,留待浓缩及鉴定。 6DEAE-纤维素的再生与保存：先用15mol/LaCl0.3mol/L NH4A溶液流洗几遍，再用0.0o醋酸铵溶液（H6.5）洗涤平衡后可反复使用。（四）浓缩 将纯化后的-球蛋白溶液量其体积,每毫升加葡聚糖凝胶G-5干胶颗粒025g，吸取水分，摇动2-3分钟，离心5分钟（转/分),

40、上清液即为浓缩的球蛋白溶液，用吸管吸至另一种小试管中,留待电泳鉴定。 （五）电泳法鉴定 1.准备：在28c醋酸纤维薄膜无光泽面距一端.5cm处用铅笔轻划一条线，表达点样的位置。 2浸泡醋酸纤维薄膜：将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上,使膜条自然浸湿下沉，浸泡一般要不小于2小时，最佳过夜，充足浸透至膜上没有白色斑痕。 3点样:将充足浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，吸取少量血清滴于玻片上，用光片或加样器的钢口蘸取血清，平直印在点样线上,待血清完全浸入薄膜后移开。另点样一条膜条,吸取少量已纯化的-球蛋白溶液滴于玻片上,其他操作同上述血清点样。注意点样位置与血清薄膜一致,以便比较迁移率

41、。 4.电泳：将点样膜条置于电泳槽上，使点样面向下,点样端置于阴极,槽架上用四层滤纸或两层纱布作桥架,膜条与滤纸需贴紧，平衡约5分钟后接通电源,调节电压00-110V,稳定电流为0.4-06mAcm宽膜条，通电5-60分钟后关闭电源停止电泳。 5.染色:用镊子将电泳后的膜条取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中,染色5分钟取出，先用蒸馏水冲一下,立即按顺序浸入不同杯的漂洗液中漂洗4-次，直至薄膜背景漂净为止,用滤纸吸干薄膜。对照观测血清薄膜与-球蛋白薄膜两者的电泳区带分析成果。血清球蛋白分离、纯化及鉴定操作流程2.0血清加2.0饱和硫酸铵溶液 混匀，放置0分钟 30转/分离心0分钟 盐析 沉淀

42、(球蛋白)，加1ml水溶解 上清液为清蛋白部分,弃去 脱盐 上葡聚糖凝胶柱 用0.02ml/L、pH6.5醋酸铵溶液洗脱,收集含蛋白质部分 纯化 上EA-纤维素柱 用002l/L、H.5醋酸铵溶液洗脱,收集含蛋白质部分 浓缩 用葡聚糖凝胶G-2干胶浓缩 鉴定 用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 注意事项 1.由于醋酸铵是挥发性盐类,故溶液配备时不得加热,配好后必须密封保存,以防pH及浓度发生变化,否则会影响所分离蛋白质纯度。 2.用HCl解决DEAE-纤维素时,时间不适宜过长,否则EAE-纤维素会发生变质。 试剂 . 0.3mo/醋酸铵溶液(pH 6.5)：称取醋酸铵23.13，加蒸馏水约800ml溶解

43、,用酸度计精确调制节至pH6.(用稀氨水或稀乙酸),再加蒸馏水定容至1000ml。 20.02mo/L醋酸铵溶液（ 6.5)：取液用蒸馏水稀释15倍,在精确调节至pH5。 . 1.5ml/LNCl-0.3moH4Ac溶液:称取NaCl 77g,溶于.3mol/L N4Ac(pH.5）中定容至1000ml。 4. 饱和硫酸铵溶液:称取固体硫酸铵850g，加入1000ml蒸馏水中,在0-80oC搅拌促溶，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 5. 0g/L磺基水杨酸 .0/L 醋酸钡：3.5mHAc + .6g Ba(OH） 蒸馏水至00ml。 7.5mo/LHl溶液 8 0

44、5o/L aOH溶液 9. H.6巴比妥缓冲液:称取巴比妥钠12.76g，巴比妥，1.66用蒸馏水加热溶解后，再加蒸馏水至1000ml。 10.氨基黑10B染液：称取氨基黑B 0.5g 溶解于50甲醇中，再加冰醋酸0ml及蒸馏水4ml。 11.漂洗液：量取95乙醇5ml，加冰醋酸5ml,蒸馏水50m混匀。 12.葡聚糖凝胶G2 （Sephadex25)。 1DA- 纤维素。 1.正常血清。 （周晓慧)实验十二 动物肝组织中核酸的提取和鉴定原理动物组织中的核糖核酸（NA)与脱氧核糖核酸(DN)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。肝组织中的核蛋白可用水提取，再用酚破坏核酸与蛋白质之间的结合键，并用乙醚抽

45、提除去蛋白质及其他杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。核酸（RA，DN)可被硫酸水解产生磷酸、有机碱（嘌呤和嘧啶）及戊糖（核糖或脱氧核糖)。此三类化合物可用下列措施鉴定：磷酸 能与钼酸试剂作用生成磷钼酸,后者在还原剂的作用下还原形成钼蓝,常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡、维生素等。3PO4+1H2MO4 3PO412MoO +12O 钼酸 磷钼酸还原剂H342Mo3 H3P6o33M25 钼蓝嘌呤碱 能与苦味酸作用形成针状结晶。核糖 经与强酸（盐酸或硫酸）共热生成糠醛,后者与3，5二羟甲苯（5甲基-1，3-苯二酚,苔黑酚orciol)反映，缩合而成绿色化合物。脱氧核糖 在强酸中加热可生成-羟基酮基戊

46、醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。操作（一） 动物肝组织中核酸的提取1.将两只小白鼠处死,剖腹取出肝脏,用清水除去血液后置于研钵中(或用兔肝2-5g)加入净砂少量，研磨至糊状，再加蒸馏水3ml继续研磨分钟。1 再加入0%苯酚5l，研磨10分钟后倒入一圆底离心管中，离心5分钟（约250r/min）。 3.将上层液体移于另一圆底离心管中,加乙醚m,管口覆盖聚乙烯薄膜后用拇指将管口按住，用力振摇1分钟（或用玻璃棒搅拌)。离心5分钟后吸取所有下层液体于另一圆底离心管中。4.于该管中加入95%乙醇ml，并用玻璃棒搅拌约2分钟，离心3分钟后倾去上清液,沉淀即为核酸。（二)核酸的水解在核酸沉淀管内加入%硫

47、酸4l摇匀，置沸水浴中加热5分钟,即得核酸水解液。用流水冷却后进行下列定性实验。(三）核酸组分的定性鉴定1磷酸的鉴定：取试管2支,编号,按下表加入试剂,摇匀,于沸水浴中2-3分钟,观测两管颜色之变化。试剂（滴)测定管(U）对照管（B)核酸水解液%硫酸钼酸试剂4%维生素C10-402.嘌呤碱的鉴定:取试管1支，加入饱和苦味酸约2ml,再加入核酸水解液6滴，摇匀,静置于室温中,观测有无黄色针状结晶浮现。3.核糖的鉴定:取试管两支,编号,按下表操作。试剂（滴)测定管(）对照管(B)核酸水解液%硫酸拜耳氏试剂969摇匀,于沸水浴中加热分钟后,观测两管颜色的变化。.脱氧核糖的鉴定:取试管两支，编号,按下

48、表操作。试剂（滴)测定管（U)对照管（B）核酸水解液5%硫酸二苯胺试剂2-40-00摇匀,于沸水浴中加热0分钟,观测两管颜色的变化。注意事项1.在制备肝匀浆时要充足研磨，破坏肝组织。2.肝组织可取自小鼠、家兔或猪肝,但以兔肝效果较好。以公斤家兔计，兔肝重70g左右,每实验室仅需1只家兔。3.实验中使用乙醚、乙醇等易燃溶剂,又要使用沸水浴,如用明火加热者应注意防火，以防发生事故。试剂1.90%苯酚溶液。2乙醚。3.5%乙醇。4.5%硫酸。.%维生素C溶液（已氧化变质的维生素不能用)。6钼酸试剂:钼酸铵5溶于100l蒸馏水中，再加入浓硫酸15ml。冷却后加蒸馏水至1000ml,冷处保存(一种月内不

49、变质)。7饱和苦味酸溶液 苦味酸约1.3g，溶于100ml蒸馏水中,静置过夜。临用前取上清液。8拜耳（Bl)氏试剂 称取1.5g3，-二羟甲苯,加入浓盐酸500ml,再加10%氯化高铁20至0滴。临用前配制，冰箱保存。.二苯胺试剂 取二苯胺1溶于00l冰乙酸(A.R.)，加入275ml浓硫酸。临用前配制，储于棕色瓶中。(王鲁华)实验十三 动物组织中DNA的提取原理动物组织中的基因A均以脱氧核糖核蛋白的形式存在。在浓氯化钠（12mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（.1mo/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可

50、运用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS解决,使DNA与蛋白质分开,再用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DN溶于上层水相中，加入适量的95%乙醇，DN钠盐即沉淀析出。为避免酶解，提取时应加入D二钠(乙二胺四乙酸）。得到的样品中D含量可用二苯胺法定量测定。NA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中转变成-羟基-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物,可用比色法测定。操作 1.A的分离纯化：(1)将0只小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用01mol/ NaC-0.15molETA二钠溶液洗去血液，剪碎,加入0m 0.1moLNal-.15m

51、oL DA二钠溶液,置于匀浆器中研磨，待成糊状后，将糊状物离心1分钟(40/min)弃去上清液，沉淀用14olL al-0.15mol/LET二钠溶液洗二三次。即反复加入50ml 0.1l/L Cl-0.15l/L ET二钠溶液,搅匀,离心。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。（2)向上述沉淀物加入0.14mlL NaCl-1ol/L EDT二钠溶液,使总体积为ml,然后滴加5%SS溶液ml,边加边搅拌。加毕,置60oC水浴中保温10分钟(不断搅拌）,溶液变得粘稠并且略透明,取出冷至室温。此环节使核酸与蛋白质分离。 （）加入5olL NaCl溶液10ml，使aC最后浓度为1olL,搅拌1分钟,加入

52、约一倍体积氯仿-异丙醇混合液，振摇0分钟，离心10分钟（40min)。沉淀与下层液弃去，取上层液加入1.5倍体积95乙醇,边加边用玻棒搅拌,DN丝状物即缠在玻棒上。 （）将DNA粗品置于27l 1mol/L NaC-0015mlL柠檬酸三钠溶液中,再加入3ml .ml/ Nal.ml/L柠檬酸三钠溶液,搅匀。待丝状DNA重新溶解后,加入一倍体积氯仿异丙醇混合液，振摇0分钟,离心（400/n)10分钟。可用氯仿异丙醇反复抽提,直至界面处不再浮现蛋白质凝胶为止。取出上层液加入5倍体积的5%乙醇，边加边搅拌，NA丝状物即缠在玻棒上。 (5)取出丝状DNA，依次用8%、5及无水乙醇各洗一次,真空干燥。

53、留待定量测定。2.鉴定(1）原则曲线的绘制：取干试管支,编号,按下表加入试剂：试 剂(ml)025DA原则液(50gl）00.240.081.0.5mo过氯酸1.00.8060.20二苯胺试剂2.02.2.02.02混匀,0oC恒温水浴中放置1小时。冷却后，于60nm波长处进行比色。以各管光密度为纵坐标,DN含量为横坐标作图。(2）样液测定:称取干燥的样品DNA 5g溶于l 5mmol/ aCl溶液中，再按原则DNA溶液同法解决。然后,取1.0ml样液，加二苯胺试剂2.l，置0oC恒温水浴1小时,测定光密度。对照原则曲线求得A量。成果与计算按下式计算样品中DNA的百分含量:注意事项1本实验也可

54、用新鲜兔肝10g进行DNA的提取，本法提取的DNA已有一定限度的解聚。2.其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等,对二苯胺显色反映有干扰,测定前应尽量除去。3.样液中DN含量应控制在g/ml左右。4.如无匀浆器,可用研钵研磨破碎组织。试剂15 mol/LNaC溶液:将93g NaCl溶于蒸馏水，稀释至100l。2 0.1mol/NaC-0.15mlL DA二钠溶液:溶8.18g Nal及55.3gET二钠于蒸馏水，稀释至10ml。3.25%DS溶液:溶25g十二烷基硫酸钠于00l45% 乙醇。4氯仿-异丙醇混合液：氯仿：异丙醇241(VV)515molLa-.molL柠檬酸三钠溶液:氯化钠.77g及柠檬酸三钠.g溶于蒸馏水，稀释至100ml。60015/L Nal-0015l/柠檬酸三钠溶液：取0ml试剂5，稀释至00l。.%乙醇。895%乙醇。9.无水乙醇。1二苯胺试剂:A液:二苯胺(如不纯,需在0乙醇中重结晶次)1.5g,溶于10l冰乙酸（AR),再加浓硫酸1.5l，贮于棕色瓶。B液:1m乙醛溶于10m蒸馏水，随用随配。临用时，将20l A液与01ml B液混合即得。111o/过氯酸溶液:将10ml 过氯酸（70)用蒸馏水稀释至10l。125lL过氯酸溶液:取50ml 1mol过氯酸，用蒸馏水稀释至0l。13.5mmolLaOH溶液：NaOH 0.02溶于蒸馏