氢气对氧化损伤结肠腺癌细胞的保护作用及机制

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1、氢气对氧化损伤结肠腺癌细胞的爱护作用及机制穆怀博;盛庆丰;吴伟;吕志葆【摘要】ObjectiveToexploretheeffectofhydrogensalineinoxidativestressinsultedenterocytes.MethodsCaco-2andIEC-6cellsweredividedas3groups:control,modelandhydrogentreatedgroups.CellsincontrolgroupwastreatedwithnormalRPMI1640medium.ModelgroupwastreatedwithRPMI1640mediumcont

2、ainingantimycinA.CellsinhydrogentreatedgroupswastreatedwithRPMI1640mediumcontainingantimycinAandH2.Levelsof02-、H202adnOH;Mitochondrialmembranepotential;MDAand8-OH-G:CellapoptoissandLDHactivity;Proinflammatoryfactors(IL-6、TNF-a、IL-1、anti-inflammatoryfactors(IL-10),expressionsofNrf2andthedownstreamtar

3、getgenes(HO-1、SOD、Cat、GPx);Expressionofphosphorylation-Nrf2weredetectedforfurtherstudy.ResultsWefoundthatH2ef-fectivelyreducethereactiveoxygenspecis,cellapoptosisandactivityofLDHinculturemediumandimprovedthemito-chondrialmembranepotential.H2activatedthephosphorylationofNrf2.H2significantlyreducedthe

4、releaseofinflammatorycytokinesandpromotedthedownstreamgenesexpressionsofNrf2.ConclusionsOurworkdemonstratedthatH2showedfavorableabilityinnecrotizingenterocolitistreatment.ThemechanismwasbecloselyrelatedwithNrf2-AREsigna-ling.%目的：间接研讨氢气对氧化损伤肠上皮细胞的爱护作用及其机制。方法取结肠腺癌Caco-2细胞与IEC-6细胞株，分别分为对比组、模型组及观看组。对比组采

5、纳常规RPMI1640培育基、模型组采纳含抗霉素A的RPMI1640培育基、观看组采纳含氢气及抗霉素A的RPMI1640培育基培育。检测各组以下指标：氧自由基（O2、H2O2和OH）水平；线粒体膜电位；氧化代谢产物丙二醛（MDA）和8-羟基鸟嘌呤（8-OH-G）:细胞凋亡率和乳酸脱氢酶（LDH）活性；促炎症因子（IL-6、TNF-a、IL-ip）、抗炎症因子（IL-10）、转录因子核因子-E2相关因子2（Nrf2）及其下游靶基因（HO-1、SOD、Cat、GPx）表达；磷酸化Nrf2蛋白表达。结果与模型组比较，观看组细胞内氧自由基水平降低，线粒体膜电位提升，细胞凋亡率及LDH活性降低，促炎症因

6、子、抗炎症因子、转录因子Nrf2及其下游靶基因表达增加，磷酸化Nrf2蛋白表达增加。结论氢气对氧化损伤的结肠腺癌细胞有爱护作用；其机制可能与调节Nrf2/ARE通路有关。依据本讨论结果推想氢气对氧化损伤肠上皮细胞有爱护作用。期刊名称】山东医药年(卷),期】2022(000)006【总页数】4页（P4-7）【关键词】坏死性小肠结肠炎;结肠腺癌;氢气;Nrf2-ARE信号通路;氧化应激反应【作者】穆怀博;盛庆丰;吴伟;吕志葆【作者单位】上海交通高校附属儿童医院，上海220000;上海市儿童医院;上海交通高校附属儿童医院，上海220000;上海市儿童医院;上海交通高校附属儿童医院，上海220000;

7、上海市儿童医院;上海交通高校附属儿童医院，上海220000;上海市儿童医院正文语种】中文【中图分类】R34氧化应激导致的炎症反应是新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)发病的重要缘由16。讨论证明，氢气具有抗氧化和抗炎等作用。本课题组前期讨论发觉氢气可明显提高肠上皮细胞中内源性抗氧化系统关键的核转录因子Nrf2的表达710，但详细机制不清晰。因结肠腺癌细胞与肠上皮细胞与对氧化应激的反应相像,故我们于2022年18月观看了氢气对氧化损伤结肠腺癌细胞的爱护作用，间接研讨氢气对氧化损伤肠上皮细胞的爱护作用及其机制。1.1细胞培育人结直肠腺癌细胞株Caco-2及IEC-6购自中国科学院细胞库。以含10%胎牛

8、血清的RPMI1640培育基，于苯并芘、饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培育，细胞呈单层贴壁生长。取对数生长期的细胞进行试验，细胞密度为0.5x1061x106/mL。1.2氢气对Caco-2细胞内氧自由基和QH水平影响的观看取对数生长期Caco-2细胞分为三组(细胞密度为0.5x1061x106/mL)。对比组采纳RPMI1640培育基培育，模型组模型组采纳含10pg/mL抗霉素A的RPMI1640培育基培育；观察组采纳含0.6mmol/L氢气、30pg/mL抗霉素A的RPMI1640培育基培育。培育30min后，按说明书操作步骤染色，激光扫描共聚焦显微镜(OlmpusFV1000)采集图像

9、和荧光信号，分别检测细胞内和QH水平。按试剂盒说明书操作。1.3氢气对Caco-2细胞线粒体膜电位影响的观看取Caco-2细胞，分组及处理同1.2。处理30min后用线粒体荧光染料染色，激光扫描共聚焦显微镜采集图像和荧光信号，检测线粒体膜电位变化；结果以荧光信号值表示。按试剂盒说明书操作1.4氢气对Caco-2细胞丙二醛(MDA)和8-羟基鸟嘌呤(8-OH-G)水平的影响的观察取Caco-2细胞，分组及处理同1.2。处理24h后常规消化、离心、洗涤并收集细胞。依据脂质氧化检测试剂盒(Abcam公司)说明书操作，用酶标仪在532nm处测定吸光度值，计算脂质氧化终产物MDA水平;依据核酸氧化ELI

10、SA检测试剂盒（Abeam公司）步骤操作，检测DNA氧化产物8-0H-G水平。1.5氢气对Caco-2细胞凋亡和乳酸脱氢酶（LDH）活性影响的观看取Caco-2细胞，分组及处理同1.2。处理24h后常规消化、离心、洗涤并收集细胞。依据AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（MolecularProbes公司）说明书操作，分别加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色液，进行流式细胞仪检测（BD公司）,AnnexinV-FITC为绿色荧光，碘化丙啶为红色荧光，计算凋亡细胞比例。并在荧光显微镜下观看和采集图像。检测培育液中LDH活性，结果以U/L表示。按LDH细胞毒性检测试剂盒（Abeam公司

11、）说明书操作。1.6氢气对Caco-2、IEC-6细胞促炎症因子、抗炎症因子、转录因子Nrf2下游靶基因表达影响的观看取对数生长期Caco-2、IEC-6细胞，分别分为四组（细胞密度为0.5x1061x106/mL）。对比组用RPMI1640培育基培育，模型组用含10pg/mL抗霉素A的RPMI1640培育基培育，氢气组（用含0.6mmol/L氢气的RPMI1640培育基培育；观看组用含0.6mmol/L氢气和30pg/mL抗霉素A的RPMI1640培育基培育。处理12h后，采纳RT-PCR法检测各组促炎症因子（IL-6、TNF-a、IL-邛）、抗炎症因子（IL-10）、Nrf2及其下游靶基因

12、血红素氧合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、连环蛋白（Cat）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）基因表达。各引物序列依据GenBank中的相应引物序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成。结果以相对表达量表示。按试剂盒说明书操作。1.7统计学方法采纳SPSS12.0统计软件。计量资料以s表示。首先行方差齐性检验，方差齐的多个样本均数比较用单因素方差分析（one-wayANOVA）和SNK-q检验。Pv0.05为差异有统计学意义。2.1 Caco-2细胞氧自由基水平观看组、H2O2和QH均低于模型组（P均0.05）,与对比组比较差异无统计学意义。见表1。2.2 Caco-2细胞线粒体膜电

13、位观看组为67890989，对比组为965411245，模型组为47890768;观看组低于对比组，高于模型组（P均0.05）。2.3 Caco-2细胞MDA和8-OH-G水平各观看组Caco-2细胞内MDA和8-OH-G水平均低于模型组（P均0.05），与对比组相比差异无统计学意义。见表2。2.4 Caco-2细胞凋亡率和LDH水平观看组Caco-2细胞凋亡率和LDH活性均低于模型组（P均0.05），与对比组相比差异无统计学意义。见表3。2.5 Caco-2、ICE-6细胞促炎症因子、抗炎症因子、Nrf2及其下游靶基因表达Caco-2及ICE-6细胞促炎症因子、抗炎症因子、转录因子Nrf2及

14、其下游靶基因表达分别见表47。由表47可见，模型组Caco-2、ICE-6细胞促炎症因子水平高于对比组提升（P均0.05）。观看组Caco-2.ICE-6细胞促炎症因子水平低于较模型组（P均0.05），高于对比组（P0.05）;模型组抗炎症因子水平高于模型组（P均0.05），低于对比组（P均0.05）；细胞转录因子Nrf2及其下游靶基因水平高于模型组（P均0.05）及对比组（P均0.05）。氧化应激是指机体在患病各种有害刺激时氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤8,9。急性氧化应激反应可通过直接或间接损伤DNA引起组织的严峻损伤，持续慢性的氧化应激反应亦被认为是多种常见疾病（包括肿瘤）的

15、发病缘由之一。氧化损伤细胞的特征性表现为，线粒体内活性氧聚集,氧自由基水平提升;进而膜电位下降，线粒体膜通透性增加，释放细胞因子;细胞因子与Caspase家族结合，进而诱导细胞凋亡1618。目前针对氧化应激反应开发了多种抗氧化剂，但临床应用效果并不抱负。以往多数人认为氢气是生理惰性气体，不具有生物学活性。但近年讨论发觉，氢气在体内可发挥抗氧化作用。1975年曾有学者报道，呼吸高压氢气可通过抗氧化作用抑制动物皮肤肿瘤形成，但当时未引起学术界的重视。Ohsawa等1,102007年报道在动物试验中，氢气可选择性清除最具细胞毒性的活性氧自由基羟自由基，从而爱护细胞并显著改善脑缺血再灌注损伤。氢气溶解

16、在液体中可选择性中和羟自由基和过氧亚硝酸阴离子，而二者是氧化损伤最重要的介质。因此认为氢气治疗脑缺血再灌注损伤的基础是选择性的抗氧化作用1115。本讨论结果显示观看组Caco-2细胞中、H2O2以及QH水平显著低于模型组，说明氢气可对氧化损伤细胞有爱护细胞线粒体膜电位高于模型组氧化代谢产物MDA、8-OH-G表达低于模型组，表明氢气可减轻细胞的氧化损伤。讨论发觉，转录因子相关因子2(Nrf2)是细胞氧化应激反应中的关键因子，是细胞抗氧化还原的中枢调整者,Nrf2通过与抗氧化反应元件(ARE)相互作甩诱导编码抗氧化蛋白和口相解毒酶的表达，在细胞的防备爱护中发挥重要作用。本讨论观看了氢气对氧化应激

17、损伤细胞Nrf2-ARE信号通路的调整作用。Nrf2属于锌指蛋白(bZIP)CapnCollar家族中的一员，可激活多种细胞爱护性蛋白的表达13,17。本讨论观看组Caco-2细胞和IEC-6细胞受到抗霉素A诱导的氧化损伤时，Nrf2mRNA和蛋白表达有所提升，这可能是细胞自身的适应性反应，说明细胞已经启动抗氧化损伤的爱护机制。讨论证明，细胞受到氧化损伤后会引发一系列炎症反应，促炎症因子表达提升。本讨论模型组炎症因子水平明显高于对比组，而氢气组明显低于模型组，说明氢气对炎症因子的释放有抑制作用，可抑制细胞内炎症反应的发生。讨论证明,Nrf2的下游基因均参加了细胞内清除自由基和炎症反应。本讨论观

18、看组及模型组Nrf2及其下游基因表达均提升，而观看组表达明显高于模型组；提示两组细胞Nrf2-ARE通路均被激活，此可能为氢气抗氧化损伤作用的分子生物学基础。综上所述，氢气能够降低抗霉素A诱导的结肠癌腺细胞内氧化损伤，表现为清除细胞内自由基，修复氧化损伤的线粒体膜电位，降低氧化代谢产物，抑制细胞凋亡，这一爱护作用可能是通过调整Nrf2-ARE通路实现的。1 通信者简介：吕志葆(1963-)，男，医学博士，教授，主任导师，讨论方向为儿童肿瘤、遗传代谢性和诞生缺陷性疾病。E-mail:【相关文献】OhsawaI,IshikawaM,TakahashiK,etal.Hydrogenactsasath

19、erapeuticantioxidantbyselectivelyreducingcytotoxicoxygenradicalsJ.NatMed,2007,13(6):688-694.2 ValkoM,LeibfritzD,MoncolJ,etal.FreeradicalsandantioxidantsinnormalphysiologicalfunctionsandhumandiseaseJ.IntJBiochemCellBiol,2007,39(1):44-84.3 SteinhublSR.WhyhaveantioxidantsfailedinclinicaltrialsJ.AmJCard

20、iol,2022,101(10A):14-19.4 DoleM,WilsonFR,FifeWP.Hyperbarichydrogentherapy:apossibletreatmentforcancerJ.Science,1975,190(4210):152-154.5 CaiJ,KangZ,LiuWW,etal.HydrogentherapyreducesapoptosisinneonatalhypoxiaischemiaratmodelJ.NeurosciLett,2022,441(2):167-172.6 CaiJ,KangZ,LiuK，etal.Neuro-protectiveeffe

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