分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展

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1、分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展摘 要 西瓜是世界上重要的水果之一。分子标记技术在西瓜研究中的应用，给西瓜的遗传育种工作带来了极大的便利。目前，分子标记已成功应用于西瓜亲缘关系和遗传多样性分析、图谱构建、重要性状基因的连锁标记和杂种纯度鉴定等诸多领域。本文从种质资源遗传多态性与亲缘关系、遗传图谱的构建、目标性状的连锁分子标记与分子标记辅助育种、品种及杂交种纯度鉴定等方面展开综述，探讨近年来分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展。关键词 分子标记，西瓜，遗传多样性，遗传图谱Applications of MolecularMarker on Watermelon Genetics

2、and Breeding ProgramsAbstract Watermelon is one of the important fruits in the world. It would be becoming great conveniences for watermelon breeding program in virtue of molecular approaches. So far, DNA Marker techniques would be widely used in the area of species relationships, genetic diversitie

3、s, linkage map construction, important trait genotyping and linked gene mapping, molecular marker assisted breeding, and cultivar purity indentification and so on. In this paper, we reviewed the research progresses of watermelon in the gentics and breeding program, in particular mentioned above.Key

4、words molecular markers, watermelon, genetic diversities, genetic linkage maps引言分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记，分子标记技术的出现使作物育种的间接选择成为可能，提高了遗传分析的准确性和选育的有效性，对科学、快速地鉴定种质、检测种子的纯度和真实性、保护新品种的知识产权等具有重要意义。广义的分子标记指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶；狭义的分子标记概念只是指DNA标记，这个界定现在被广泛采纳(周延庆，2005)。分子标记技术根据其核心技术可将其分为三大类：

5、第一类是以分子杂交(Southern杂交)为核心的标记技术，包括RFLP标记、DNA指纹技术、染色体原位杂交等；第二类是以聚合酶链式反应PCR技术为核心的标记技术，包括RAPD标记、SSR、ISSR、AFLP、STS、SCARs、AP-PCR、SRAP标记等；第三类是一些新型的分子标记，如SNP标记、EST等。分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的新的一种遗传标记，反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，直接反映了基因组DNA间的差异，有许多明显的优越性(周延庆，2005)，表现为：(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季

6、节、环境限制，不存在表达与否等问题；(2)数量极多，遍布整个基因组；(3)多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；(4)表现中性，不影响目标性状的表达；(5)许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。西瓜是世界上重要的水果之一。长期的育种实践表明，西瓜种质资源间的遗传多态性很低。分子标记技术在西瓜研究中的应用，无疑给西瓜的遗传育种工作带来了极大的便利。目前，已成功应用于西瓜亲缘关系和遗传多样性分析、图谱构建、重要性状基因的连锁标记和杂种纯度鉴定等诸多领域：(1)国内外许多学者进行了西瓜遗传多样性的分析研究，结果发现西瓜具有较低的遗传多样性；(2)构建了数张西瓜的遗传连锁图谱，并

7、将重要性状连锁基因进行了定位；(3)对我国部分西瓜栽培品种进行了品种鉴定与纯度检测的研究。1 种质资源遗传多态性与亲缘关系分子标记所检测的是植物基因组DNA水平的差异，因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较，大大提高了结果的可靠性。分子标记一方面可用于品种资源的鉴定与保存，研究作物的起源与发展进化，确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间遗传距离，指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据；另外，通过亲缘关系分析，可以纠正形态分类中一些不恰当的结论以及目前育种工作中存在的一些问题。西瓜栽培品种与其近缘野生种遗传资源比较丰富，种植资源遗传多态

8、性的研究以及物种亲缘关系的鉴定、评价是对其进行有效利用的关键。迄今，国内外许多学者进行了西瓜遗传多样性的分析研究。早期学者进行西瓜遗传多样性的同工酶与贮藏蛋白分析，但检测到的多态性极低。Navot等(1996)曾用同工酶与蛋白质来研究西瓜的遗传多样性与遗传关系方面发现在384份西瓜材料中，其中26个酶位点中只有4个具有多态性；在西瓜栽培种(Citrulluslanatus)与西瓜野生种(Citrulluscolocynthis)之间存在着丰富的同工酶与种子蛋白的多态性，首次确定西瓜中19种蛋白编码基因之间的连锁关系。Biles等(1989)分析了8个商业品种的11个蛋白位点，在子叶、茎与叶组织

9、上无差异，只在伤流液中发现蛋白谱带上有差异，并可能与抗枯萎病有关，这也是仅有的一篇在栽培品种间确有蛋白谱带差异的报道。Zhang X.P.等(1993)选用53个引物对西瓜的3个栽培品种与1份栽培种(Citrulluslanatus)的野生类型材料以及1份栽培种与野生种的杂交后代进行的RAPD检测结果表明在全部5份材料中，多态性为62.3 %，而在3个栽培品种内，多态性仅为10.1 %，其平均遗传距离为0.2400.263。李严等(2005)用SRAP标记进行西瓜杂交种遗传多态性的研究, 利用25个引物组合对生产上推广的20个西瓜杂交种进行扩增，从中筛选得到20个多态性引物组合，共产生135个

10、多态性条带，平均每个引物组合产生7.11个多态性条带，显示了较高的多态性比率。赵虎基等(1999)用RAM标记对籽用西瓜的12个品种(系)和西瓜种内其他变种的4个品种(系)进行了遗传多样性的检侧，结果表明始选出的14个随机引物均能扩增出多态性片段，反应了不同品种(系)的遗传差异，并计算了这12个西瓜品种(系)的Nei相似系数，建立了UPGMA系统树，得出它们之间的亲缘关系。Lee SL等(1996)对39份西瓜材料进行RAPD检测与聚类分析，其平均遗传距离的变动范围为00.366。Jarret等(1997)用SSR标记对西瓜种质的亲缘关系进行了研究，证明栽培品种间也有较多的差异。Hashizu

11、me等(1993)通过RAPD分析发现，在西瓜(Citrullus lanatus)的杂交种Fijihikari的双亲间能产生多态性的引物仅为3 %。郭军等(2002)用RAPD标记对国内外32份西瓜主栽品种与其骨干亲本及野生类型的遗传亲缘关系进行研究，从720个随机引物中筛选出15个能产生稳定多态性的引物用于RAPD反应，实验结果不仅从分子水平验证了西瓜是遗传基础狭窄的作用，而且在分子水平对西瓜传统分类与地理生态型分类进行了分析。刘文革等(2004)对西瓜二倍体及同源多倍体的遗传差异进行AFLP分析，结果表明大部分引物组合扩增出的不同倍性西瓜之间的AFLP谱带无明显差异，表明不同倍性西瓜间的

12、多态性很低。李晓慧等(2007)用SRAP标记对不同倍性西瓜的多态性进行分析，结果表明不同倍性西瓜之间SRAP多态性较低。段会军等(2007)用AFLP标记对48个西瓜品种进行多态性分析，结果表明西瓜品种间同源性较高、遗传基础狭窄，多数品种亲缘关系较近。段会军等(2006)用RAMS标记对河北省不同地区的3个西瓜枯萎病病株分离物Fon1、Fon2、Fon3各10个单孢菌株进行了基因组多态性分析，结果表明同一病株分离物的不同单孢菌株之间在分子水平上存在遗传差异性。刘立功等(2004)用RAPD标记对国内外26份西瓜材料进行遗传亲缘关系研究，结果将供试26份材料分为6个类群：1个美国生态型类群、2

13、个中间生态型类群、1个东亚生态型类群、2个野生类群，并将京欣一号杂种纯度鉴定的RAPD特异标记K14-1500与N04-600成功转化为SCAR标记，同时应用于京欣一号纯度鉴定实践。赵虎基等(2000)对西瓜种内12个品种(系)进行了核型分析，据其染色体的对称性、着丝点位置等核型参数推断出了它们之间的相对进化程度，揭示了其亲缘关系的远近，从而对西瓜亲本的选择选配和遗传育种研究提供了一定的理论依据。李艳梅等(2007)用AFLP标记对57份西瓜材料进行了多态性分析，根据DNA谱带计算品种间遗传相似系数，其范围在0.240.99之间，平均相似系数为0.70，表明西瓜品种间遗传基础狭窄。2 遗传图谱

14、的构建利用分子标记构建遗传连锁图谱，将对西瓜遗传育种及其重要性状基因的定位、克隆具有重要意义。目前，已发表的西瓜分子图谱有10余张。Hashizume(1995)用一个近交系(H-7；Citrullus lanatus)和一个野生类型(SA-1；Citrullus lanatus)杂交获得的BC1群体(H-7SA-1)SA-1构建了一个最初的西瓜分子遗传连锁图谱，该图谱包括58个RAPD标记，1个同工酶标记，1个RFLP标记和2个形态标记，分为11个连锁群，全长524 cM，Hashizume等(2003)又用以上两个亲本杂交的F2群体为材料进行了图谱构建，该图谱包括477个RAPD位点、53

15、个RFLP位点、1个同工酶位点及23个ISSR位点，分为11个连锁群，覆盖了2 384 cM的分子图谱，同时对果皮硬度、果肉颜色等进行了QTL定位。Hawkins等(2001)用枯萎病抗感不同品种NHMPI296341获得的杂交F2、F3群体，分别构建出两张涵盖112.9和139.0 cM的RAPD连锁图，许多RAPD标记和枯萎病生理小种1(Fom-1)和2(Fom-2)的抗性基因有不同程度的连锁。Levi等(2001，2002)用(PI296341-FRNHM)NHM的BC1群体，构建出总长1 295 cM、含有17个连锁群、155个RAPD标记和1个SCAR标记的分子遗传连锁图谱，之后利用

16、测交群体(Griffin 14113NHM)PI386015构建了总长1 166.2 cM的遗传连锁图谱。范敏等(2000)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系(Citrullus lanatus var.1anatus)97103与可溶性固形物含量低、皮厚、抗枯萎病的野生西瓜种质(C.lanatus var.citroides) PI296341含有96个标记的连锁遗传图谱，该图谱由11个连锁群构成，覆盖基因组长度为1 203.2 cM，位点间平均间距为12.53 cM，总的位点数为96个，包括85个RAPD标记、3个SSR标记、3个同工酶标记、4个形态标记及1个抗枯萎病生理

17、小种1的基因标记。张仁兵等(2003)用同样的亲本杂交所得的重组自交系F8的群117个单株作图群体，构建了包含87个RAPD标记、13个ISSR标记，分为15个连锁群，覆盖基因组1 027.5 cM。易克等(2003)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341作为亲本，获得F8的重组自交系群体，用SSR和ISSR标记技术构建了包括38个SSR标记和10个ISSR标记组成的分子图谱，该图谱总长558.1 cM，平均图距为11.9 cM，之后易克等(2004)用同样亲本获得F2S7重组自交系群体，通过AFLP技术对群

18、体扩增，建立了有150个标记组成的图谱，包括17个连锁群，覆盖基因组1 240.2 cM，两个标记间的平均图距为8.3 cM。郭绍贵等(2006)用西瓜栽培品种97103和野生品种PI296341-FR为亲本构建了由117个稳定株系组成的F2S8代重组自交系群体，利用RAPD、SSR、AFLP和SCAR标记构建了该RIL群体的高密度遗传图谱，覆盖基因组总长度1 383.8 cM，平均图距6.8 cM。车克鹏等(2003)用AFLP标记对30个西瓜核心种质材料进行了遗传分析，建立了这30个材料的DNA指纹图谱，在该图谱中每个材料均有其独特的指纹，材料之间可相互区分开来，然后将重要抗病种质材料“P

19、I296341”的AFLP特异带转化为生产上可直接利用的SCAR标记。3 目标性状的连锁分子标记与分子标记辅助育种获得紧密连锁的标记是成功开展重要性状标记辅助选择的关键。许勇等(1998)用RAPD技术采用BSA法进行西瓜野生种质(PI296341)抗枯萎病基因连锁的研究，结果表明西瓜野生种质PI296341抗枯萎病生理小种1的抗性由单显性基因控制，RAPD标记OPPOL/700与其抗病基因连锁，其遗传距离为30 cM。另一方面，许勇等(1999，2000)将西瓜野生种质PI296341抗枯萎病生理小种l的抗性基因连锁的RAPD标记OPPO1/700进行克隆、测序，Southern杂交证明此标

20、记为1个单拷贝，并转化为SCAR标记，简化了SCAR扩增产物的检测技术。张显等(2005)用RAPD标记以BSA法对西瓜隐性核不育材料Sel8的不育基因进行了研究，结果220个引物中仅有引物S1167、S357在不育株DNA中扩增出了多态性特异片段，在可育株DNA中未扩增出多态性片段，验证结果表明引物S1167在12个不育材料中的138个不育株全部扩增出特异性片段，可以区分不育株与可育株，对特异性片段进行回收、克隆和测序，显示S1167扩增特异片段有2 391个碱基对。刘海河等(2004)用RAPD标记对西瓜G17AB隐性核雄性不育系的不育株和可育株gDNA进行比较分析，筛选到可育株与不育株的

21、特异扩增谱带A123K片段，并用该引物对单个不育株后代育性分离群体进行了RAPD分析，从而确定A123K与育性基因的遗传距离为8.1 cM。马少芹等(2006)以抗病毒西瓜野生种质P.I.595203与感病普通西瓜自交系98R为亲本采用单粒方式得到109个F3代株系，分别对亲本、F1及109个F3代株系进行苗期ZYMV-CH接种鉴定，通过F3带群体的分离情况推测得到F2代各株基因型，采用BSA在F2代建立抗基因池对640条RAPD引物筛选得到一条与ZYMV-CH抗性基因连锁的谱带AK13-644，且该标记得到验证，最后将其转化为SCAR标记SCAK13-644作为西瓜抗病毒辅助选择的标记。4

22、品种及杂交种纯度鉴定对作物品种鉴定与纯度检测是作物种子品质检验极为重要的部分，一般可采用表型差异、染色体的多态性与DNA多态性等多种方法。其中，表型差异主要采用生长测验，需要一些可辨认的特殊形态标记。但由于西瓜的标记性状数量很少，因此主要依靠果实外型与颜色来进行品种鉴定，因而要进行早期鉴定是十分困难的。由于西瓜本身遗传基础狭窄, 造成品种间多态性较低，国内外曾利用各种技术进行西瓜多态性分析，有些研究表明利用蛋白质或同工酶谱带的差异可以区分部分西瓜品种(王玺等，1996；李丽，2000)，有的却认为同工酶和蛋白质很难或者无法在栽培品种之间产生多态性(张仁兵等，2003；易克，2003)。王鸣刚等

23、(2003)以不同西瓜杂交种及亲本自交系为材料，研究利用RAPD技术鉴定西瓜杂种的纯度及种质的方法，认为在反应条件适合、引物选择正确的情况下，RAPD技术完全适合于西瓜杂交种纯度的鉴定；欧阳新星等(1999)曾针对“京欣1号”及其父母本筛选了320个RAPD引物，仅得到1个引物可以区分母本和杂交种，不能区分父本和杂交种，对42份国内外西瓜种质材料进行了RAPD分析，从600个随机引物中筛选10多个重复性好、能产生多态性的引物，找到了某些特殊的RAPD谱带，但效果不太明显。闫鹏等(2007)选用100条随机引物(S71-S190)对西瓜、甜瓜杂种一代和其父、母本的种子进行RAPD分析，结果表明在

24、100条引物中筛选出4条有特征条带的引物，其中S92号引物能使甜籽一号、白兰蜜和黄河蜜6号与其母本有效区分开来；S162号、S181号引物能使甜籽一号与其母本区分开来；S175号引物能使白兰蜜与其母本区分开来；但未发现使T14E与其母本区分开来的引物。艾呈祥等(2006)以2个西瓜杂交品种(系)的种子“黑公子”和“04217”及其亲本为材料用SSR标记甄别真假杂种，结果发现多数SSR引物对自交系的扩增只出现1条带，但部分引物在某些自交系中扩增出2条带，用引物CMCT134b对“黑公子”和引物CMGA165对“04217”进行了各100粒单种子SSR鉴定，所测纯度分别为96 %和100 % ，与

25、田间纯度95.6 %和99.7 %非常接近，表明SSR标记可应用于西瓜杂交种子纯度鉴定。5 研究展望近年来国内外学者在分子标记在西瓜上的应用上做了大量研究，促进了西瓜的遗传育种工作。目前，主要以RAPD、AFLP、SSR等分子标记为主，在种质资源利用方面应加强不同类型种质资源多态性的研究与利用，进行西瓜种质资源的创新；遗传图谱对于基因定位至关重要，图谱上包括的标记数越多，分布越均匀，基因定位就越精细，高密度分子遗传图谱的绘制不仅使遗传学研究取得重大进展，对分子标记辅助育种选择技术和基因图位克隆技术的发展也将产生巨大的推动作用，因此今后应加强以下几个方面的研究：在遗传图谱构建方面，开展新型分子标

26、记的应用，如SNP标记、EST标记在西瓜上的应用；开发SSR、SRAP等分子标记引物，充分利用不同分子标记技术以加快遗传图谱的整合工作，完善高密度遗传标记连锁图谱；开展西瓜数量性状位点定位以及西瓜抗逆性、抗病性等性状基因的研究，建立转育特异性状的分子标记辅助选择系统，为分子设计育种奠定基础，以加快西瓜品种改良进程；加强分子标记在鉴定西瓜种子纯度上的应用研究，为西瓜种子质量的检测提供快速、简便、科学实用的检测鉴定技术。参考文献Zhou Y.X. ed.,2005,The application of molecular markers in plant research,Chemical ind

27、ustry publishing house,China,Beijing,pp.3-4(周延庆,主编,2005,DNA分子标记技术在植物研究中的应用,化学工业出版社,中国,北京:2005,pp.3-4)Navot N. and Zamir D.,1996,Linkage relationships of 19 protein coding genes in watermelon,Theoretical and Applied Genetics,72:274-278Biles C.L.,Martyn R.D. and Wilson H.D.,1989,Isozymes and general p

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47、P., Xu Y.,Liang C.Y.,2003,Gong G.Y.,Weng M.L.,Zhang H.Y.,Jin D.M. and Wang B.,2003,AFLP Fingerprint and SCAR Marker of Watermelon Core Collection,Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Sinica),6:731-735(车克鹏,许勇,梁春阳,宫国义,翁曼丽,张海英,金德敏,王斌,2003,西瓜核心种质的AFLP指纹图谱和SCAR标记,植物学报,6:731-735)Xu Y.,Ouyang X.X. and Zhang H.Y.,199

48、8,Identification of A Molecular Marker Linked to Chilling Tolerance in Watermelon Wild Germplasm Using Random Amplified Polymorphic DNA,Yuanyi Xuebao(Acta Horticulturae Sinica),25(4):397-398(许勇,欧阳新星,张海英,1998,西瓜野生种质耐冷性基因连锁的RAPD标记,园艺学报,25(4):397-398)Xu Y.,Ouyang X.X. and Zhang H.Y.,1999,Identification

49、 of a RAPD Marker Linked to Fusarium Wilt Resistant Gene in Wild Watermelon Germplasm (Citrullus lanatus var.citroides),Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Sinica),41(9):952-955(许勇,欧阳新星,张海英,1999,与西瓜野生种质抗枯萎病基因连锁的RAPD标记,植物学报,41(9):952-955)Xu Y., Zhang H.Y.,Kang G.B.,Wang Y.J. and Chen K.,2000,Studies of Molecu

50、lar Marker-assisted-selection for Resistance to Fusarium Wilt in Watermelon (Citrullus lanatus) Breeding,Yichuan Xuebao(Acta genetica Sinica),27(2):151-157(许勇,张海英,康国斌,王永健,陈杭,2000,西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择的研究,遗传学报,27(2):151-157)Zhang X.,Wang M. and Zhang J.S.,2005,Identification RAPD Markers Linked to Male St

51、erility in Watermelon,Yuanyi Xuebao(Acta Horticulturae Sinica),3:438-442(张显,王鸣,张进升,2005,西瓜隐性核雄性不育基因的RAPD标记,园艺学报,3:438-442)Liu H.H.,Hou X.L. and Zhang Y.P.,2004, Marker Linked to a Male Fertile Gene in Watermelon G17AB Lineepartmen,Guoshu Xuebao(Journal of Fruit Science),21(5):491-493(刘海河,侯喜林,张彦萍,200

52、4,西瓜核雄性不育育性基因的RAPD标记,果树学报,21(5):491-493)Ma S.Q., Xu Y. and Zhang H.Y.,2006,Identification of the molecular markers linked to the resistance gene to Zucchini yellow mosaic virus Chinese strain in watermelon,Zhiwu Bingli Yanjiu(Acta Phytopathologica Sinica),6(1):68-73(马少芹,许勇,张海英,等.西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁分子标

53、记研究,植物病理学报,2006,36(1):68-73)Wang X. and Zhang G.Z.,1996,Studies on PAGE Method for the Variety Identification of Hybrid Water Melon Seeds,Shenyang Nongye Daxue Xuebao(Journal of Agricultural University of Shenyang),27(1):92-94(王玺,张国忠,1996,PAGE法鉴定西瓜杂交种研究初报,沈阳农业大学学报,27(1):92-94)Li L.,Zheng X.Y. and Xi

54、ng B.T.,2000, The application of SDS-PAGE Protein electrophoretic techniques in F1 generation of hybrid purity appraisal,Zhongzi(Seed),6:51-53(李丽,郑晓鹰,邢宝田,2000,SDS-PAGE蛋白电泳技术在F1代杂交种纯度鉴定中的应用,种子,6:51-53)Wang M.G.,Xie F. and Guo X.L.,2003,Study on Identification of the Purity of Hybrid Seeds of Watermel

55、on by Using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Method,Xiamen Daxue Xuebao Ziran Kexueban(Journal of Xiamen University(Natural Science),2(42):112-118(王鸣刚,谢放,郭小玲,2003,利用RAPD方法鉴定西瓜杂种纯度的研究,厦门大学学报自然科学版,2(42):112-118)Ouyang X.X.,Xu Y. and Zhang H.Y.,1999,Rapid Identification of Hybrid Purity in Water

56、melon Using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD),Nongye Shengwu Jiashu Xuebao(Journal of Agriculttural Biotechnology),7(1):23-27(欧阳新星,许勇,张海英,1999,应用RAPD技术快速进行西瓜杂交种纯度鉴定的研究,农业生物技术学报,7(1):23-27)Yan P.,Zhang J.N. and Chen Y.,2007,Purity identification of F1 hybrid seeds in watermelon and melon based

57、on RAPD markers,Gansu Nongye Daxue Xuebao(Journal of Agricultural University of Gansu),2:43-46(闫鹏,张建农,陈雨,2007,西瓜和甜瓜杂种一代种子纯度的RAPD鉴定,甘肃农业大学学报,2:43-46)Ai C.X.,Yu X.M. and Liu Q.Z.,2006,Seed Purity Test of Hybrid Varieties of Watermelon by SSR Marker,Xibei Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica),26(10):2006-2010(艾呈祥,余贤美,刘庆忠,利用SSR标记鉴定西瓜杂交种纯度的研究,2006,西北植物学报,26(10):2006-2010)