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1、细胞实验一：细胞实验一：miR-181b对对HUVEC功能影响功能影响1、TNF-影响影响miR-181b表达表达(A)Real-time qPCR analysis of miR-181b in response to TNF-(10 ng/ml)in HUVECs.短时间作用短时间作用不同时间点作用不同时间点作用2、TNF-作用下，作用下，miR-181b影响影响HUVEC粘附因子表达粘附因子表达蛋白、蛋白、mRNA、细胞上清细胞上清三个层面证明三个层面证明ICAM-1、VCAM-1、E-selectin是影响是影响ECs与与WBC粘附的主要分子粘附的主要分子3、TNF-作用下，作用下，m
2、iR-181b影响影响细胞粘附胞粘附细胞实验二：细胞实验二：miR-181b靶点的确定靶点的确定1、TNF-(+)(-)，WB筛查靶点筛查靶点只使用了只使用了miR-181b-m及对照及对照2、荧光素酶报告系统实验、荧光素酶报告系统实验1、仅使用、仅使用miR-181b；2、载体使用浓度梯度、载体使用浓度梯度3、用真核细胞表达载体将、用真核细胞表达载体将miR-181b导入细胞导入细胞3、miR-181b与靶点结合区域的确认与靶点结合区域的确认(D)Normalized luciferase activity of a reporter containing 3 UTR of importin
3、-3,predicted miR-181bbinding sites,or mutated miR-181bbinding sites.The reporter was cotransfected with either pcDNA3.1 empty vector or pcDNA3.1miR-181b.*P 0.05.4、miRNP-IP分析靶点分析靶点mRNA富集富集(E)miRNP-IP analysis of enrichment of importin-3 mRNA in HUVECs transfected with miRNA negative control or miR-18
4、1b mimics.*P 0.01.细胞实验三：细胞实验三：miR-181b对下游通路的作用对下游通路的作用1、荧光素酶报告系统检测、荧光素酶报告系统检测miR-181b对对NF-B及及VCAM1影响影响TNF-(+)(-)条件下，条件下，HUVECs中中miR-181b对NF-B活性及活性及VCAM1promoter活性的影响活性的影响2、miR-181b通通过作用于靶蛋白影响作用于靶蛋白影响NF-B活性活性(F)Luciferase activity of reporters containing the NF-B concatemer in cells transfected with
5、miRNA negative control or miR-181b mimics in the absence or presence of importin-3 gene lacking its 3 UTR.*P 0.05.3、miR-181b对对HUVECs NF-B活性的影响活性的影响4、TNF-(+)，miR-181b影响影响NF-B下游下游mRNA表达表达瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染3、对下游蛋白表达的影响、对下游蛋白表达的影响In vivo 1：miR-181b对粘附因子表达的影响对粘附因子表达的影响VCAM-1 mRNA及蛋白水平检测及蛋白水平检测尾静脉注射，瞬时转染尾静脉注射，瞬时转染VCAM-1组织原位杂交组织原位杂交组织水平确定组织水平确定miR-181b靶蛋白靶蛋白结束！结束！
miR-181b与炎症关系实验解读
