原位杂交实验操作步骤

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1、原位杂交实验操作步骤原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和 定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的 发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型 原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（ POD） 检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶（AP ）检测系统（MK1032 型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD ）检测的最终信号为棕 黄色，而碱性磷酸酶（ AP ）检测的信号为紫色，因后者信号比较突出， 所以一般采用后一

2、种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多， 所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是 DNA 探针，即是用 DNA 与组织中的 mRNA杂交，另一种是RNA探针，即用RNA与组织中的mRNA杂 交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈， 所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶（AP） 检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标 记、原位杂交三部分。（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切 片紧密粘附在玻片上，可以用于后

3、面的洗脱。一般一张载玻片上可以 贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需 要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买， 目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名 称等, 切片应该贴在此面，切勿贴到反面。（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子 个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置 于 180 摄氏度以上烘烤 6 小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一 次性塑料手套等。1.2溶液配制0.1M PB 缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH

4、2PO4?2 H 2O 0.5928 g,加入200ml ddH 2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶 中，再加入200 d DEPC,充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制 两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。多聚甲醛（PFA）溶液：向配制好的有磁力搅拌子的0.1M PB缓冲液中加入8g PFA, 60 C加热搅拌，并加入几粒NaOH颗粒，直至完全溶解。20%蔗糖溶液：向另一瓶配制好的0.1M PB缓冲液中加入40g蔗 糖，完全溶解。2?取新鲜组织 用事先烘烤过的剪刀和镊子（冷却至室温），选取合浦珠母贝新 鲜外套膜、腮、闭壳肌等组织，迅速放入配好的4%多聚甲醛（PFA） 溶液中，取组织的过程应

5、戴口罩、一次性手套，尽量避免污染和减少 RNA降解。3?组织固定、脱水（1 ）将选取的组织在4 %多聚甲醛（PFA）溶液中固定5?6h。（2）用预先烘烤好的镊子将固定好的组织夹入 20%的蔗糖溶液 中，于4C沉淀，直至组织块完全沉到瓶底（20h以上）。4?冰冻切片切片在冰冻切片机上进行，生物系张秀芳老师实验室就有冰冻切 片机，一般按工作时间收费，需提前预约。切片之前将组织切成小块（按照研究要求的 方向）后放在固定盘上，用专用胶将组织块完全包围，然后放入冰冻 切片机里的制冷区冷凝，待组织块完全冷凝后将盘放于切片区的操纵杆上准备切片。切片的厚度一般调至10 将切好 的组织粘到盖玻片上用多聚赖氨酸处

6、理过的一面（切忌贴到反面），同时在毛玻璃的 一面用铅笔做好标记。每张玻片上贴 5?6 个切片，可以是几种不同的组织。将切完的玻片放 在冰上，干燥一段时间后，放于-20C保存。切片的质量可以用显微镜 进行检验。（二）RNA探针标记1将目的片段（用于标记的DNA片段，300bp以上）连接到T 载体上，如PGEM-T easy载体（转录启动子为T7和SP6），转化到大 肠杆菌JM109细胞中，摇菌，提取质粒，质粒浓度尽可能大。2、质粒线性化：将提取的质粒用载体上靠近 SP6 端的特异性酶 （目的片段和T7端不能含有，只有SP6端有的酶切位点），如Ndel， 于37摄氏度酶切10h以上。3、琼脂糖凝胶

7、电泳检验线性化以后的质粒，须为一条平直的条带， 并利用DNA Marker确定质粒的大致浓度。4、探针标记及纯化（1）配置10ul的标记反应体系：丙醇。一2 0摄氏度放置2小时，然后4摄氏度12000g离心30分钟， 弃上清。50ul 70 %预冷乙醇洗一次，7500g离心 5分钟，弃上清。晾干沉淀，溶于10ul无核酸酶的水中。取0.5ul作RNA凝胶电泳，其余-20摄氏度保存备用。（三）原位杂交1、实验准备1.1器具准备镊子两把，100ml量筒一个，染色缸三个（依杂交的玻片数量来确 定，每个染色缸可以同时放5张玻片），100ml试剂瓶一个，1000ml 试剂瓶三个，200ml试剂瓶三个。以上

8、器具都在180 C以上的温度烘 烤6h以上。吸水纸，湿盒一个，杂交炉一个。1000卩I、200卩丨和 20卩1枪头各若干，121 C高压灭菌25min以上。1.2溶液配制DEPC水：1000mldd H2O中加入1ml DEPC，充分摇匀，于室 温过夜，高压灭菌。考虑到 DEPC 水用量较大，一般同时准备两瓶 DEPC 水。3%柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g, PH2.0左右。2X SSC: 1000ml DEPC 水中加入 NaCL17.6g，柠檬酸三钠 8.8go0.5X SSC: 150ml DEPC 水中加 50ml 2 X SSC 即可。0.2 X SSC: 80 ml

9、 DEPC 水中加 120ml 0.5 X SSC 即可。0.5M TBS : 1000ml DEPC 水中力口 NaCL30g , Tris 1.2g，纯乙 酸 0.40.5ml, PH7.2-7.6。0.01M TBS （PH9.0-9.5 ） : 1000mlDEPC 水中加入 NaCL9g , Tris1.2g。2、杂交步骤(1)灭活内源性碱性磷酸酶 (AP )：将切片用 20%的乙酸处理 10min，以灭活内源性的碱性磷酸酶。暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋 白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37C或室温消化90 120 秒。0.5M TB

10、S洗3次X 5分钟，DEPC水洗5分钟。3) 预杂交：湿盒的准备干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏 水充分润湿。按照每张切片20卩1加预杂交液。40C恒温3小时，吸取多余液体，不洗。(4) 稀释探针：将用地高辛标记好的 RNA 探针于 65C 加热变性 8min，用杂交液稀释为2g/ml。(5) 杂交：每张切片加20 1 1稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻 片盖在切片上，50 C杂交过夜。(6) 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2X SSC洗5min x 3次。(7) 消化残余的RNA :用2x SSC稀释RNase A到20卩g/ml，处 理 30m in。(8) 洗涤：2x SSC于37C洗涤10m

11、in x 3次；0.5X SSC室温洗 涤 5min x 3 次；0.2 xSSC室温洗涤5min x 3次。(9) 滴加封闭液：37C处理30min，吸去多余液体，不洗。(10) 滴加生物素化鼠抗地高辛： 37C 处理 1h, 0.5M TBS 洗涤 5min x 4次。注意：勿用其它缓冲液或水洗。(11) 滴加 SABC-AP : 37 C处理 30min , 0.5M TBS洗涤 5min x 4次。注意：勿用其它缓冲液或水洗。12) BCIP/NBT 显色：用 0.01M TBS 将 BCIP/NBT 稀释 50 倍， 混匀。显色液加至标本上，一般37C下避光显色20min。若无背景出

12、现可继续显色。 用DEPC水充分洗涤。13) 水溶性封片剂封片。附I DNA探针处理方法用DNA做杂交探针的话，处理方法如下：1. 将目的片段(用于标记的DNA片段，300bp以上)用无菌双蒸水 稀释至161 l。2. 将稀释好的DNA用沸水浴(100C) 10min，冰上3min以上变 性。3. 加411事先摇匀的DIG-High Prime，混匀，2000rpm离心 5min。4. 37C反应2h以上，通常过夜至20ho5. 力口 211 0.2M EDTA(PH8.0中止反应或65C加热10min中止 反应。6. 20 C保存(一般可以保存一年)附II过氧化物酶(POD )检测(MK10

13、30型)试剂盒原位杂交操作步 骤一、溶液配制1、DEPC 水：lOOOmldd H2O 中加入 1ml DEPC ,充分摇匀， 于室温过夜，高压灭菌。考虑到 DEPC 水用量较大，一般同时准备两 瓶DEPC水。2、3%柠檬酸：100mlDEPC水中加入柠檬酸3g, PH2.0左右。3、2 x SSC: 1000ml DEPC 水中加入 NaCL17.6g，柠檬酸三钠 8.8g。4、0.5X SSC: 150ml DEPC 水中加 50ml 2 x SSC 即可。5、0.2 x SSC: 80 ml DEPC 水中加 120ml 0.5 x SSC 即可。6、0.5M PBS: 1000ml 蒸

14、馏水加 NaCL30g , Na2HPO4?12H 2O 6g, NaH2PO4?2 H2O 0.4 g,PH7.2-7.6。二、原位杂交操作灭活内源性过氧化物酶(POD)将切片用0.5% H2O2/甲醇室温处理30分钟以灭活内源性的过氧化物酶，后用DEPC水洗3次。(2) 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋 白酶( 1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37C或室温消化90- 120秒。0.5M TBS 洗3次X 5分钟，DEPC水洗5 分钟。(3) 预杂交：湿盒的准备干的杂交盒底部垫上吸水纸，用蒸馏水充分润湿。按照每张切片20卩加预杂交液。40C恒温3小时，

15、吸取多余液体，不洗。(4) 杂交：每张切片加 20 卩稀释好的探针，将原位杂交专用盖玻 片盖在切片上，42C杂交过夜。杂交后洗涤：揭掉盖玻片，2 x SSC于37C洗涤10min X 3次；0.5X SSC室温洗涤5min X3次；0.2 x SSC室温洗涤5min x 3次。(7)滴加封闭液：37C处理30min，吸去多余液体，不洗。 滴加生物素化鼠抗地高辛：37C处理1h, 0.5M PBS洗涤 5min x 4次。注意：勿用其它缓冲液或水洗。(9) 滴加 SABC : 37C 处理 20min , 0.5M PBS 洗涤 5min x 4 次。注意：勿用其它缓冲液或水洗。(10) 滴加生物素化过氧化物酶：37C处理20min , 0.5M PBS洗涤5min x 4次。(11) DAB 厠 -aDAB Im 一 DEPCA、Bn曲諭、(vr、莒册m毎 E 肃 37CVI篦半厠 20min。醫。aDEPC養囂。(12) 录豐象渊黑、窃當。 pis、Hi耳。