细胞计数方法------细胞计数板法

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1、细胞计数措施-细胞计数板法实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板。2.将细胞悬液吸出少量，滴加在盖片边沿,使悬液布满盖片和计数板之间，静置mi，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算:细胞数/mL四大格细胞总数/410个/ml（注:当细胞诸多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数,求出每小格的细胞数，取平均值m,16即每个格的平均

2、值。因此，细胞密度=m1610个ml)阐明:公式中除以4，由于计数了4个大格的细胞数。公式中乘以0由于计数板中每一种大格的体积为:1.0m（长）.0mm（宽)01m（高）=0.1mm 而 ml=000ul=100mm(注意：镜下偶见有两个以上细胞构成的细胞团，应按单个细胞计算,若细胞团10%以上，阐明分散不好，需重新制备细胞悬液。）=细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格,中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种:一种

3、是计数辨别为6个大方格（大方格用三线隔开）,而每个大方格又提成25个小方格；另一种是一种计数辨别成2个大方格（大方格之间用双线分开）,而每个大方格又提成6个小方格。但是不管计数区是哪一种构造,它们均有一种共同特点，即计数区都由40个小方格构成。计数区边长为m，则计数区的面积为1m，每个小方格的面积为400m。盖上盖玻片后,计数区的高度为0.1mm,因此每个计数区的体积为.1m3，每个小方格的体积为00m。使用细胞计数板计数时,先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。二、细胞计数板使用措施.视待测菌悬液浓度，加无菌水合适稀释(斜面一般稀释10倍),以

4、每小格的菌数可数为度。2.取干净的细胞计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片。3将菌悬液摇匀,用滴管吸取少量,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边沿摘入一小滴(不适宜过多），让菌悬液运用液体的表面张力布满计数区,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，导致计数区深度的升高),然后加盖盖玻片（勿使产气愤泡)。静置半晌，使细胞沉降到计数板上,不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观测并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近,观测时应削弱光照

5、的强度。计数时若计数区是由16个大方格构成,按对角线方位,数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格构成的计数区，除数上述四个大方格外,还需数中央1个大方格的菌数(即0个小格)。为了保证计数的精确性，避免反复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的记录应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线,数左线不数右线,以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。见下图：即本格中计数细胞为3个。6.对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算。每个样品反复计数23次(每次

6、数值不应相差过大,否则应重新操作),按公式计算出每mL(g)菌悬液所含细胞数量。7.测数完毕，取下盖玻片,用水将细胞计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。三、细胞计数板-计数公式、6格25格的细胞计数板计算公式:细胞数/ml=10小格内细胞个数100010000稀释倍数1、2格16格的细胞计数板计算公式:细胞数/ml=80小格内细胞个数/04000稀释倍数四、血细胞计数板计数的误差重要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求精确？血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利,器材解决、使用不当,稀释不精确，

7、细胞辨认错误等因素所导致的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够精确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差（fied ror）。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高纯熟限度和校正仪器而避免或纠正,但细胞分布误差却难于彻底消除。因此，搞好红细胞计数的质量控制一般需采用如下措施。1避免技术误差,纠正仪器误差(1)所用器材均应清洁干燥,计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合规定或通过校正。计数板的鉴定：规定计数室的台面光滑、透明,划线清晰,计数室划线面积精确。必要时采用严格校

8、正的目镜测微计测量计数室的边长与底面积,用微米千分尺测量计数室的深度。美国国标局（BS）规定每个大方格边长的误差应不不小于1%,即10.1mm，深度误差应不不小于2%,即.1.002m。若超过上述原则，应弃之不用。血盖片应具有一定的重量,平整、光滑、无裂痕,厚薄均匀一致,可使用卡尺多点测量（至少在9个点),不均匀度在0mm之内。必要时采用平面平行仪进行测量与评价，规定呈现密集平行的直线干涉条纹。最简朴的评价措施是将干净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表达盖片平整、厚薄均匀。同步，合格的盖片放置在计数室表面后,与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的

9、盖片与其她盖片紧密重叠后，在掠射光线下观测,如见到完整平行的彩虹条纹表达另一枚盖片质量也符合规定。目前临床实验室多采用一次性微量采血管采集毛细血管血，除注意定点购买使用信誉较好厂家的产品外,还应对每一批量的采血管进行抽样检查，可通过水银称重法或有色溶液比色法进行校正，误差不应超过1%。（2)红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒。(3）严格操作，从消毒、采血、稀释、充池到计数都应规范，特别应注意的是血样稀释及充池时既要作到充足混匀，又要避免剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性布满计数室，避免产气愤泡,充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边沿为宜。(4）报告法定计量单位。2.缩小计数域

10、误差或分布误差 由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poon分布（ ）,而我们所能计数的细胞分布范畴是有限的，由此导致的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效措施就是尽量扩大细胞计数范畴和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范畴，只要能将误差控制在容许范畴内即可。Berson指出，当使用同一支吸管、同一面计数室，计数0.mm2面积的细胞数,有望将V控制在可接受的7以内。对于红细胞计数而言，由于红细胞数量较多,在计数室中显得比较“拥挤”,根据Pisn公式推断， 。欲将误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数0个红细胞，因此规定计数五个中方格的红细

11、胞。事实上Berson还通过实验证明,红细胞的计数域误差为s=092 ,较理论误差(Poissn分布误差）要小。 3排除异常标本的干扰 白细胞数量在正常范畴时，相对于红细胞数量来讲,其影响可忽视，但如白细胞过高（1109L）,则应对计数成果进行校正。措施是：实际RBC=计得BC-WBC。如当红细胞换算后为31012/L、白细胞换算后为00/时,病人实际红细胞数应为.4101。在高倍镜下计数时,避开有核细胞。有核细胞体积比正常红细胞大，中央无凹陷,无草黄色折光，可隐约见到细胞核。此外，当病人急性严重贫血时网织红细胞可提前大量释放,也给红细胞计数带来一定的干扰,并且影响网织红细胞绝对值计算成果。其

12、校正措施有待探讨。Usng outig Chaber Formcrbioly, cell clture, d any applications that qie u o ssension f cellsit isneessay to etminecellcoentatin One can ofe deteine eldnsity of suspeso spetrophoomriclly,howeve thatom odetrminatioes not allw n assessmnt fcell iabiliy, nr canoe distnguish cel pes. dvice usfr

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20、hs u coue 1 ticles ina vlumof .02 mm-cd, giving you 187/(0.02）=950 prticles per mm-cubed. Thee are 100ubic ilmetes in on cbic entimete（ame asamlliliter）, s youariclecounts 9,50,00 per ml. Cells rotnle eno toreure ont ove a rgr sfce area.For exmpl， u ihtcout the totl uerof cel in thefoulargeonesquare

21、s pluthe idde mbned. Each suarehas srace reo 1 m-squard an depth of . mm，giing it a olme of .1m-cbed. Suppose thatyou conted5 cells (tota)in the five suaes.You tn av 125 cels per0.5 mm-ce, whs 50el/mm-cube. Aain, muliply by100 todtrie cel cot per (50,000）. Setie you wll eed to dile acl suspension ge

22、t theell denit lwenogfrcountn. ta se you will need t mutiply your final coun y th dilfato. For mpl, suppohat fr cutin you had to dilute aupenson of Chlydomn 0 fold. Suppose youobtained a fia counto 50，000cel/ml a dscribed bve. Then the count n the original （unilute) suspesin s 10 x 50，00 whihis 2,00，000 cell/ml.