细胞库建立标准

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1、 细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的规定 (一)细胞系/株历史资料 1细胞系/株来源资料 应具有细胞系/株来源的有关资料,如细胞系株制备机构的名称,细胞系株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最佳从细胞来源实验室获得，也可引用正式刊登文献。 人源细胞系株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地区来源、年龄、性别及生理状况的有关资料。动物来源的细胞系株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地区来源、年龄、性别、病原体检测成果及供体的一般生理状况的有关资料。 2.细胞系株培养历史的资料 应具有细胞分离措施、细胞体外培养过程及建立细胞系株过程的有关资料,涉及所使用的物理、

2、化学或生物学手段，与否有外源添加序列,以及细胞生长特性、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择措施等。同步还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测成果的有关资料。应提供细胞培养液的具体成分。如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其她生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、制备措施、质量控制、检测成果和质量保证的有关资料。(二)细胞库的建立 细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相似的及能持续稳定传代的细胞种子。 1原材料的选择 建立细胞库的多种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中有关规定。神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。 培养细胞用牛血清应来源

3、于无牛脑海绵体脑病流行地 区的健康牛群，其质量原则应符合规定（附录XIID）。 不得使用人血清作为细胞培养液。如需使用人血白蛋白,则须使用有批准文号的合格制品。 消化细胞用胰蛋白酶应进行检测,证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。特别应检测胰蛋白酶来源的动物也许携带的病毒,如细小病毒等。 用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或内酰胺(actam)类抗生素。 2细胞培养操作的规定细胞培养生产人员应定期检查身体。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作;在同一工作日进行细胞操作前,不得操作或接触有感染性的微生物或动物。 .建立细胞库 细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库

4、。如为引进的细胞,可采用主细胞库和工作细胞库构成的二级细胞库管理。在某些特殊状况下,也可使用主细胞库一级库，但须得到国务院药物监督管理部门的批准。(1）原始细胞库(CB) 由一种原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或通过克隆培养而形成的均一细胞群体,通过检定证明合用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液,定量均匀分装于安瓿,于液氮或一130如下冻存,即为原始细胞库，供建立主细胞库用。(2)主细胞库（MCB) 取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或一0如下。这些细胞必须按其特定的质控规定进行全面检定，所有合格后即为主细胞

5、库,供建立工作细胞库用。（3)工作细胞库(CB)工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖,达到一定代次水平的细胞,合并后制成一批均质细胞悬液,定量分装于安瓿,保存于液氮或一130如下备用，即为工作细胞库。冻存时细胞的传代水平须保证细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一种亚批制品。复苏后的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产的最高限定代次。所制备的C必须经检定合格,方可用于生产。细胞库的管理 每种细胞库均应分别建立台账，记录放置位置、容器编号、分装及贮存安瓿数量,取用记录等。细胞库中的每 支细胞安瓿均应注明细胞系/株名、代次、安瓿号、冻存日期，贮存容器的编号等

6、。 冻存的细胞存活率应在90以上。冻存后的细胞,应至少做一次复苏培养并持续传代至衰老期,检查不同传代水平的细胞生长状况。 主细胞库和工作细胞库分别寄存。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开寄存。(三)细胞库细胞的检定 细胞检定重要涉及如下几种方面:细胞鉴别、外源因子污染和内源因子的检测、致瘤性检测等。必要时还须进行细胞染色体核型检查。这些检测内容对于MCB细胞和C细胞均合用。 建立细胞库的实验室应至少进行一次MCB细胞的全面检定，检定应涉及:细胞鉴别实验,细菌、真菌检查,支原体检查，外源病毒因子检查等。每次建立W后,均应按规定项目进行检定。1.细胞鉴别实验 新建细胞系/株、细胞库（C和WCB）和

7、生产结束时的细胞应进行鉴别实验，以确觉得本细胞,无其她细胞的交叉污染。细胞鉴别实验措施有多种,涉及细胞遗传检测(如特性染色体标志）、遗传标志检测（如DNA指纹图谱、TR图谱、基因组二核苷反复序列)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性抗血清）和生物化学鉴别法(犹如工酶实验)等。可选其中一种或几种措施,但均须经国家药物检定机构承认。细胞表型特性与遗传学特性相结合来判断，更有助于细胞鉴别。 细菌、真菌检查 取细胞培养上清液样品 支原体检查 取细胞培养上清液样品,应为阴性。 4.细胞内、外源病毒因子检查 应注意检查细胞系株中与否有细胞来源物种中潜在的可传染的病毒,以及由于操作带入的外源性病毒。对细

8、胞进行病毒检查的种类及措施,须根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定。 (1)细胞形态观测及红细胞吸附实验（简称血吸附实验) 取混合瓶细胞样品，接种至少个细胞培养瓶或培养皿,待细胞长成单层后换维持液，持续培养两周。每日镜检细胞,细胞应保持正常形态特性。 细胞至少培养14天后,分别取1/细胞培养瓶或培养皿，用2.5豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附实验。加入红细胞后置830分钟，然后置2253分钟,分别进行镜检,观测红细胞吸附状况,成果应均为阴性。 新鲜红细胞在28保存不得超过天，且溶液中不应具有钙离子或镁离子。 （2）不同细胞传代培养法检测病毒因子 自MCB或WC来源的细胞,分别接种下

9、列三种单层细胞,涉及猴源细胞、人源二倍体细胞和同种不同批的细胞。每种单层细胞接种至少1000个活细胞或裂解细胞及其培养上清液，每种细胞至少接种2瓶。接种样品量应占维持液的4以上，培养至少14天。 取培养7天的上清液各一瓶，分别接种于同种细胞培养,盲传一代，继续培养7天,观测细胞病变并进行细胞形态观测及红细胞吸附实验。 若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒(CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观测28天,应无细胞病变。同步，应进行血吸附病毒检测,应为阴性。 (3)接种动物和鸡胚法检测病毒因子 MB细胞或WC细胞以及增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞，须采用动物体内接种法进行外源病毒因

10、子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚（两组不同日龄)合计4组，按表1所列措施进行实验和观测。如实验到期有8以上动物或鸡胚健存，此实验成立,结合其她检测拟定成果。对于新建细胞系株，还应接种豚鼠和家兔（见表1)。豚鼠重要用于检查细胞内结核分枝杆菌，在注射前观测周,结核菌素实验为阴性者方可用于实验。家兔重要用于检测猴来源细胞中与否存在B病毒污染,也可用兔肾细胞培养法替代。动物组 规定 数量接种途径细胞浓度个活细胞ml接种细胞液量/ml只-观测天数 成果鉴定乳鼠24小时内1（2窝) 脑内 腹腔 107 .0 .1 2 应健存成鼠 20g 10 脑内 腹腔 2X06 0.03 O.5 21 应健存鸡胚911日龄

11、 1 尿囊腔 5X6 O2 34 尿液血凝实验阴性鸡胚6日龄 1 卵黄囊 2X106 .5 应存活豚鼠3550g 5 腹腔 4X10 5 5.O 42应健存,解剖无结核病变家兔.25kg 5 皮下 皮内 210s .11 21 无异常，健存 (4)逆转录病毒及其她内源性病毒或病毒核酸的检测 可采用下列措施对M细胞或WCB细胞以及增殖到或超过生产用体外细胞龄限制次的细胞进行逆转录病毒的检测。 逆转录酶活性测定采用敏感的措施，如产品增强的逆转录酶活性测定法（PER)或其她检测逆转录酶的措施，检测细胞培养液上清中逆转录酶活性。 透射电镜检查收集待检细胞,低速离心后，弃上清,沉淀中应具有110 个细胞

12、,且细胞存活率应不低于99%。在沉淀中加入固定剂,于4保存或直接包埋后制备超薄切片,置于铜网上染色后透射电镜观测。 感染性实验将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源,须使用不同的敏感细胞进行感染性实验。 这三种措施具有不同的检测特性及敏捷度,因此应采用不同的措施联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性实验，以确证与否存在感染性逆转录病毒颗粒。 小鼠来源和其她啮齿类来源的细胞系或其杂交瘤细胞系有也许携带潜在的逆转录病毒。因此，对于人一鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。如用于单克隆抗体生产的小鼠细胞系，则可不检测特异性的逆转录病毒，但

13、在生产工艺中应增长病毒灭活程序。 （5)特殊外源病毒因子的检测 应对CB细胞或WCB细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类应根据细胞系株种属、组织来源等拟定。 如鼠源的细胞系,可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生实验,检测其种特异病毒。 人源的细胞系/株,则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些状况下，也也许进行转化病毒的检测,如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。这些病毒的检测可采用合适的体外检测技术。5致瘤性检查 某些传代细胞系已证明具有致瘤性,如来源于啮齿类的细胞系BHK2、CH、C12胞等，或细胞类型属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不必做致

14、瘤性检查。 某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致瘤性，而超过某代次则具有致瘤性，如Vero细胞,则必须进行致瘤性检查。 人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系/株应进行致瘤性检查。此外,新建细胞系/株必须进行致瘤性检查。 在某些状况下,用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。 将来源于MCB细胞或C细胞的增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次，再进行致瘤性实验。 下述两种致肿瘤性实验措施可任选其一: 裸鼠至少10只,将细胞悬浮于适量无血清培养基中，使细胞浓度为每lml含510 个细胞,每只裸鼠皮下注射或肌内注射O.2ml;同步用Hea细胞或HeP-2细胞设立

15、阳性对照，阳性对照组至少10只,每只注射0.2l含0 6个细胞;可用人二倍体细胞株作为阴性对照，阴性对照组至少1只，每只注射02ml含 7个细胞。 新生小鼠（35日龄),lg小鼠10只,在出生后第0天、2天、7天和第14天，分别用O1m抗胸腺血清(AS）或球蛋白解决，然后同上每只皮下接种10 7个活细胞。并设立阳性对照组，对照组至少接种1只。 成果鉴定： 定期观测并触摸注射部位有无结节形成,且形成的任何结节均应进行双向测量并记录。 阳性对照组至少有9只有进行性肿瘤生长时，实验视为有效。 如实验组动物有进行性生长的结节或可疑病灶，应观测至少12周;若浮现的结节在观测期内开始消退,则应在结节完全消

16、退前,处死动物并进行解剖做病理及组织学检查。 未发生结节的动物，半数动物应观测2天，剖检，此外半数动物应观测2周，进行病理检查，剖检接种部位,观测各淋巴结和各器官有无结节形成，如有怀疑,进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。除上述体内法外,也可采用软琼脂克隆形成实验或器官培养实验等体外法检测，特别合用于低代次时,动物体内无致瘤性的传代细胞系。 (四)生产用细胞培养 生产用原材料的选择和细胞操作环境,应符合本规程一、(二)细胞库的建立中有关规定。 从冻存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培养，传至一定代次后供生产用。其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。从WCB取出的细胞种子增殖的细胞不得

17、再回冻保存或再用于生产。 体外培养细胞龄的计算 二倍体细胞龄以细胞群体倍增（ulatio Douing)计算,以每个培养容器细胞群体细胞数为基本，每增长一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶(:分种率）,再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶（1:)为二世代；一瓶传八瓶（1:8)则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前23内。传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。二、持续传代细胞系的特殊规定 传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来，可悬浮培养或采用载体培养,能大规模生产。这些细胞可无限传代,但到一定代次后，致瘤性会增强。因此对生产用传代细胞系应进行严格检查。应按本规程一

18、、(三)细胞库细胞的检定的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培养的规定如下： 1.用于生产的细胞代次用于生产的传代细胞系，代次均有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次,须经批准。 .在生产末期进行外源病毒因子检测对手病毒类制品，茬生产末期,对照细胞应按本规程一、（三)()细胞形态观测及红细胞吸附实验规定进行血吸附病毒检查。对于在不同步间收集合并的培养物，应在每次收集时检测对照细胞培养物。 三、人二倍体细胞株的特殊规定 新建的人二倍体细胞株必须具有如下资料:建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终结妊娠的因素、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明(医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病

19、和遗传性疾患等证明),以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面调查资料。人二倍体细胞株应在传代过程的初期,选择合适世代水平（28世代)增殖出大量细胞，定量分装后，置液氮中或一130下冻存，供建立PCB之用,待所有检定合格后，即可正式定为PCB，供制备MB用。 1染色体检查及鉴定原则 新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。对于已建株的人二倍体细胞株,如WI-38、MRC-5、2B、KMBl7等，在建立MCB时可不必进行细胞染色体检查。但如对细胞进行了遗传修饰,则须按新建细胞株进行染色体检查。 （)染色体检查 新细胞建株过程中，每82世代应做一次染色体检查,一株细胞整个生命期

20、内持续培养过程中，至少应有4次染色体检查成果。 每次染色体检查,应至少随机取1000个分裂中期细胞,进行染色体数目、形态和构造检查,并做记录以备复查。其中至少选择5个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析，并应粗数00个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。 每次染色体检查,应从同一世代的不同培养瓶中取细胞,混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。 可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。 （2)鉴定原则 对100个和0个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限（可信限0%Poson法)如表2。 表人二倍体细胞染色体分析原则 检查细胞数

21、 异 常 1000 50 100 染色单体和染色体断裂 47 2 8 构造异常 1 10 2 超二倍体 8 5 2 亚二倍体 1 90 18 多倍体 30 17 4 亚二倍体如超过上限,也许因制片过程中人为丢失染色体，应选同批号标本重新计数。 一种中期细胞内超过5条染色体,即为一种多倍体。 .无菌检查 每8世代细胞培养物,应进行无菌检查(附录A）。 3支原体检查 每812世代细胞培养物,应进行支原体检查（附录B)。 4病毒检查 二倍体细胞株传代过程中,至少对2个不同世代水平进行病毒涉及体、乙型肝炎、丙型肝炎、B病毒、艾滋病病毒检查等，成果应均为阴性。 5致瘤性检查 每81世代应做一次致瘤性检查

22、（措施见本规程一、(三)5致瘤性检查),成果应无致瘤性。 6生产过程细胞培养物检查 ()染色体检查 可根据制品特性及生产工艺，拟定与否进行生产过程中细胞培养物的染色体检查。一般，具有活细胞的制品或纯度局限性的制品,应对所用细胞培养物进行染色体检查及评价(见本规程三、1.染色体检查及鉴定原则)。但如采用已建株的人二倍体细胞生产，则不规定进行染色体核型检查。 （2)细胞鉴别实验 按本规程一、(三)细胞库细胞的检定中细胞鉴别实验进行。 (）无菌检查 按附录A进行,应符合规定。 ()支原体检测 按附录B进行，应为阴性。 (5）正常细胞外源病毒因子检测 制备病毒类制品时，于接种病毒的当天或在持续传代的最

23、后一次接种病毒时，留取此批细胞的25的细胞不接种病毒,换维持液作为正常细胞对照。与接种病毒的细胞在相似条件下培养,并按本规程一、 (三）4(）细胞形态观测及红细胞吸附实验和(2）不同细胞传代培养法检测病毒因子的规定进行外源病毒污染检查。 四、重组细胞的特殊规定 重组细胞,系通过A重组技术获得的具有特定基生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程因序列的细胞系,因此重组细胞系的建立应具有细胞基质构建措施的有关资料,如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件或培养液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查应按本规程一、(三)细胞库细胞的检定的规定进行，但还应进行下述检查: 1.细胞基质

24、的稳定性 生产者须具有该细胞系用于生产的目的基因的稳定性资料,涉及重组细胞系的遗传稳定性、目的基因体现稳定性、目的产品持续生产的稳定性，以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。 2鉴别实验 除按本规程一、(三)1细胞鉴别实验进行外，还应通过检测目的蛋白基因或蛋白进行鉴别实验。 .重组细胞产物的外源病毒因子检测 应按本规程一、(三)4(）细胞形态观测及红细胞吸附实验和(2)不同细胞传代培养法检病毒因子的规定对细胞裂解物或收获液及生产用培养基进行外源病毒因子的检测。 五、原代细胞的规定原代细胞应来源于健康的动物脏器组织或胚胎,涉及猴肾、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾或动物的胎儿和其她

25、组织，以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织,以合适的消化液消化、分散组织细胞进行培养。原代细胞不能建立细胞库,只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内使用，无法事先标定。因此，只能严格规范管理和操作措施，以保证以原代细胞为基质所生产的制品质量。 （一)动物组织来源和其她材料 1.动物组织来源 应符合凡例的有关规定。对多种动物都应有明确的健康状况和干净级别规定。 2生产或检定用猴 多采用非洲绿猴、恒河猴等，国内以恒河猴为主。应为笼养或小群混养的正常健康猴。动物用于制备细胞前，应有6周以上的检疫期，检疫期中浮现病猴或混入新猴，应重新检疫。从外面新引入猴群应做结核菌素实验及猴疱疹I型病毒（B病毒）的检查。 胎猴

26、-肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。 (二)原代细胞培养物检查 用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。 1.细胞培养原材料检查及细胞培养操作 按本规程一、（二).原材料的选择及细胞培养操作的规定进行。 2细胞培养物检查 (1）细胞形态检查 细胞在接种病毒或用于生产前,其培养物均应进行外观检查和镜检,应无任何可疑、异常和病变，否则不得用于生产。 (2）对照细胞检查 每批消化所得原代细胞留取5(或至少00m1）悬液，不接种病毒，细胞浓度和解决均与生产制品过程相似,至少观测14天,并做下列各项检查，成果均应为阴性。 细菌、真菌检查，按附录A进行。 支原体检查,按附录B进行。 外源病毒污染检查。对观测到期的细胞,按本规程一、(三)4(1)细胞形态观测及红细胞吸附实验和(2)不同细胞传代培养法检测病毒因子进行外源病毒污染检测。 原代细胞培养物特定病毒检查。原代猴。肾细胞培养应检查SV0病毒、猴艾滋病毒和病毒，应用ro细胞或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应用HK21细胞培养检查,观测细胞形态，如有可疑,应在同种细胞上盲传一代继续观测。