抗体的精制

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1、抗体的精制环境中的大部分生物（涉及病原生物)及其产物分子和某些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其她的途径刺激免疫系统,产生以抗体为主的体液免疫应答。同样用抗原人工免疫实验动物、可以获得具有特异性抗体的血清,称为抗血清(tsru)。因血清中抗体是多种抗原决定簇刺激不同细胞克隆而产生的抗体因此称多克隆抗体(polyonal atibody)。 一种细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此措施可制备单克隆抗体(onclonal ntibdy）。随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(anti

2、body cobintrialbrry)筛选制备单克隆抗体；应用基因工程技术,根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体（enierigantbo),以及催化性抗体(tylaticantbody)等的全新的抗体。第一节抗血清的制备 1免疫动物(1) 抗原：免疫动物是制备抗血清的第一步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其她蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等,必须与大分子载体连接，抗原的用量视抗原种类及动物而异,一次注射小鼠可以少至几种微克,兔、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增长,从几百g/次至几百g/次。(2) 佐剂及乳化：佐剂可以协助抗原在注射部位缓慢释放.以增长免疫刺激的效果。佐剂有

3、完全和不完全佐剂之分。完全体剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗）或棒状杆菌。弗氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1:24混合自行制备。佐剂与抗原按:1的比例混合乳化为均匀的乳液,放置后不会发生油水分离。(3) 免疫动物：常用于制备抗血清的动物有豚鼠、家兔、小鼠、大鼠、羊、马等。动物接受免疫的剂量，小鼠为1.02.mL，家免为24ml。(4) 抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和与否使用佐剂。(5) 腹腔注射,肌肉注射,皮内注射和皮下注射适合于任何抗原，这些途径重要刺激局部淋巴结发生免疫应答。初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射则只合用于可溶性抗原及分散的单细胞悬液其诱发的免

4、疫应答重要发生在脾脏。(6) 初次免疫要保证23次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的I抗体。两次免疫注射之间的时间间隔,一般34周比较适合大部分动物，小动物可间隔1014d，大动物则在2月左右:在免疫加强最后一次注射的一周内采集抗血清,可获得高水平的抗体。2抗血清的采血与保存(1) 采血：加强免疫的动物2次后,可通过耳静脉或眼球(小鼠）采血，进行抗血清效价测定。当效价达到抱负的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血。也可通过动脉放血,待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。(2) 抗血清的保存:将采血浆静置1-2小时,00rpm离心,5分钟，取上层血清,6水浴3分钟，灭活后分装,30冷冻保存

5、。第二节抗体的精制1 盐析法:除抗体外血清中具有多种其她蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反映和抗原抗体反映,抗血清可通过纯化以获得单一的抗体组分。常用的纯化IG的措施为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中其溶解度不同样,盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，由于水盐结合比水蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子量越大沉淀所需盐浓度越低。抗体在3050%饱和度的硫酸盐可析出,而白蛋白需在700%饱和度才析出。因此常用33%饱和度的硫酸胺纯化血清中的IG。盐析时为了减少抗体变性,需在进行、同步用缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。

6、盐析法只能部分纯化抗体,更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。 离子互换法：离子互换在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。它对蛋白质的辨别率高,操作简易，反复性好,成本低。按照离子互换的原理，蛋白质可从大量的缓冲液中被分离出来，因此此措施适于蛋白质的粗提物的初始纯化。离子互换原理：（1） 蛋白质的等电点是进行离子互换层析的重要根据。同等电聚焦电泳同样，离子互换层析法运用不同的蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。（2） 进行离子互换层析的最佳溶液值一般与蛋白质的等电点相差一种单位。这可使蛋白质的净电荷量既可保证将其结合在离子互换树脂上,又不需在洗脱时采用使洗脱的离子强度很大或原溶液p

7、值相差悬殊等苛刻条件。（3） 离子互换剂与蛋白质的结合。离子互换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷结合。原则的离子互换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。DAE等阴离子互换树脂侧链电荷为正。M等阳离子互换树脂侧链电荷为负。若蛋白质所带净电荷为负，则需用阴离子互换树脂进行纯化。反之则使用阳离子互换树脂。（4） 蛋白质纯化的一般程序。蛋白质的离子互换层析是根据蛋白质与离子互换树脂的选择性结合。蛋白质进入离子互换柱后，与离子互换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱。余下的蛋白质均结合在树脂上，但与树脂的亲和力各不相似,可用逐渐增长洗脱液中氯化钠浓度的措施将其逐个洗脱出来。常用离子互换剂种类常用离子互

8、换剂有离户互换纤维素和离子互换葡聚糖。目前重要根据离子互换剂的性能而分为阳离子互换剂,阴离子互换剂。下表为常用的某些离子互换剂种类3 亲和层析法：亲和层析是运用生物分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体,蛋白质与一类抗体之间,均具有专一的亲和力,在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的,变化条件可将抗原抗体解离。当把可结合的一对分子的一方(称配体）结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体,双方即结合为一整体。然后设法将它们解离,从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。载体的选择 使配体固相化的不溶件性化合物称为载体。用于亲和层析的抱负载体应当具有下述

9、持性: 高度亲水，使固相配体易于同水溶液中的相应结合物接近； 惰性载体，使载体的非专一性吸附尽量小; 具有相称量的化学基团可供活化，并在温和条件下能与较大量配体连接; 有较好的物理化学稳定性.不易受周边条件(加H、离子强度、温度、变性剂和去污剂等）的影响, 具有多孔的网状构造,能使被亲和吸附的大分子自由通过而增长配体的有效浓度； 有良好的机械性能，利于控制层析速度,最佳是均一的珠状颗粒。 抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶颗粒。球状琼脂糖凝胶获水能力很强，物理和化学性质比较稳定。它具有疏松的网状构造，可让分子量上百万的大分子产物自由通过。因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不仅可以较长期的

10、反复使用，并且可以采用蛋白变性剂作为洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液。缺陷是琼脂糖经不起有机溶剂解决，也不能进行干燥(涉及冷冻干燥)。抗体纯化中常用的配体 蛋白：蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白抗原成分,它是单一的多肽链.分子量为4分为个片段，从N末端开始的4个由58一62个氨基酸残基构成的高度同源的片段。每个片段都具有和IgG上的Fc段结合的活性,但就整个蛋白A分子而言，只能与2个c段结合，这种结合是一种疏水结合,可在一定条件下,将IgG从蛋白A解脱下来。蛋白具有良好的再生性,耐受低H反复解决的性能极性,并可采用高浓度的诸如尿素、盐酸胍或异硫氰酸钾等变性剂进行解决而不致受到永久性

11、破坏，大多数抗体都能耐受短暂的低pH解决。 蛋白G：蛋白G是链球菌表面的一种蛋白，分子量为30一3500,它对免疫球蛋白的吸附机制与蛋白A相似。蛋白G对多种免疫球蛋白的吸附能力与蛋白A不同，故在抗体的纯化上可与蛋白A互补。当某些抗体对蛋白A没有吸附能力时，它们往往会对蛋白G有吸附作用(表)。 抗原:根据抗原和抗体能形成抗原抗体复合物的特性,发展了免疫吸附技术。将可溶性抗原用化学措施偶联到不溶性载体上，使之固相化.将相应的抗血清按层析法加入柱中,抗血清中相应的抗体就与抗原特异结合，其他蛋白成分随洗脱液流出。再变化缓冲液的PH和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体上的抗原分开而被洗脱下来,从而得到纯

12、净的抗体。层析条件的选择 亲和层析一般采用柱层析法。2. 在亲和吸附时，亲和柱使用的平衡缓冲液的组分、pH和离子强度都应选择亲和双方作用最强、最有助于形成复合物的条件。根据生物大分子的特点,一般选用接近中性作为亲和吸附条件。3. 上柱时样品液一般应与亲和柱平衡缓冲液一致，一般是上柱前，样品先对平衡缓冲液进行充足透析。4. 上柱流速尽量缓慢，对流出液需进行定量测定，以判断亲和吸附效率。5. 样品通过亲和柱后,用大量的平衡缓冲液洗去杂质,直至流出液中不含蛋白。6. 然后再用洗脱液洗脱,洗脱液能削弱配体和亲和物之间的亲和力,使该结合物完全解离。7. 洗脱结束后,亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤,直到无亲和物存在时为止。再用平衡缓冲液使亲和柱充足平衡，加入防腐剂,寄存于冰箱(4）中,以备下次再用。