铜绿假单胞菌CMCC10104中青霉素结合蛋白

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1、由于抗生素可用于治疗各种感染性疾病，有的人就将抗生素作为万能药，不管得了什么病， 都用抗生素治疗。要知道，滥用抗生素，可引起许多不良的后果。因此强调合理使用抗生素， 重视抗生素的毒副作用是很有必要的。那么，该如何合理使用抗生素呢？ （1）病毒性疾病 不宜用抗生素治疗。上呼吸道感染以及咽痛、咽峡炎，大部分是病毒感染所致，因此这类疾 病无需抗生素而应使用病毒灵、病毒脞等抗病毒药物以及中草药治疗。（2）应根据细菌培 养和药敏试验结果选用抗生素。但如果受条件限制或病情危急，亦可根据感染部位和经验选 用，然而可靠性较差。一般情况下，呼吸道感染以革兰氏阳性球菌为多见。尿道和胆道感染 以革兰氏阴性菌为多见。

2、皮肤伤口感染以金黄色葡萄球菌为多见。（3）抗生素可以治病， 同时也会产生副作用，没有一个抗生素是绝对安全而无副作用的。如链霉素、庆大霉素、卡 那霉素等可损害第八对脑神经而造成耳聋。青霉素可发生过敏性休克，还会引起皮疹和药物 热。应用广谱抗生素如四环素等会使体内耐药细菌大量生长繁殖，而引起新的更严重的感染， 因此使用抗生素应有的放矢，不可滥用。（4）新生儿、老年人和肝肾功能不全的人应避免 或慎用主要经肝脏代谢和肾脏排泄的毒性较大的抗生素。（5）预防性应用抗生素要严加控 制，尽量避免在皮肤、粘膜等局部使用抗生素，因其易导致过敏反应，也易引起耐药菌株的 产生。铜绿假单胞菌CMCC10104中青霉素结

3、合蛋白-3的克隆表达和纯化引言：铜绿假单胞菌是一种能够感染植物、动物和人类的革兰氏阴性细 菌，医院中的病人因他们的肺部、血液、尿液、皮肤、和软组织被铜 绿假单胞菌感染而发病甚至死亡。铜绿假单胞菌也是一种重要的水生 病原菌，广泛分布在各种各样的水体中，并且对消毒剂、干燥、紫外 辐射等其他的物理化学因子具有很强的抗性，因此可以造成急性肠胃 炎、脑膜炎、败血症和急性皮肤病。由于铜绿假单胞菌耐药性的出现， 因此迫切需要去选择一些抗菌策略来控制它们的感染。细胞壁结构对于细菌的生存是非常的重要，青霉素结合蛋白(PBPs)是一些膜结合酶，它们主要参与到细菌细胞壁合成的后期阶 段。它们在70年前就已经被开发利

4、用，被认为是B-内酰胺类抗生素 的日标结合物。铜绿假单胞菌PAO1的基因组编码的四种高分子量的 青霉素结合蛋白(PBPs)，包括一级A酶(PBPla)和三级B酶(PBP2, PBP3, and PBP3a)，它们与大肠杆菌中对应的酶是直系同源的。同时，铜绿假 单胞菌的青霉素结合蛋白(PBP3)与大肠杆菌的对应蛋白具有42% 序列一致性。铜绿假单胞菌的青霉素结合蛋白(PBP3)是有两个部分组成的蛋 白，它包括：一个C-端的转肽酶结合到一个延伸的N-端领域。总的 来说，PBP3与其他种类的青霉素结合蛋白是相似的，虽然它缺乏 PBP2X结构所特有的C-端附属结构，但是它和其他种类的PBPS 一样，

5、都具有a-螺旋亚基或头部结构朝向PBP3的N-端，这在PBP2结构中 是没有的。种类B的青霉素结合蛋白的N-端区域的功能日前还不清 楚，但是很有可能使转肽酶的结构远离细胞内膜。在铜绿假单胞菌中PBP3是一个药物作用靶点，并且已经证明了 是大部分B-内酰胺类抗生素的重要的药物作用靶点，B-内酰胺类药物 通常是用于治疗假单胞菌属的感染。包括头孢菌素类似物、头孢霉素、 头孢他啶、哌拉西林、和注射用药物的抗生素、多利培南。然而，在 最近几年，青霉素结合蛋白的改变使得铜绿假单胞菌对B-内酰胺类的 抗生素具有耐药性。使用高剂量的哌拉西林来处理临床的分离菌，表 明了这与抗生素结合到PBPs上的减少有关。实验

6、菌株缺乏B-内酰胺 酶，在铜绿假单胞菌中PBP3的过量表达导致了它们对头孢霉素的敏感性降低。因此，进一步研究PBP3的基因和结构是很有必要很有意 义。铜绿假单胞菌CMCC 10104是一种典型的培养菌株，在中国广泛 使用。然而，它的基因组和蛋白质组学的研究没有报道过。在本研究 中，根据铜绿假单胞菌PAO1的基因组信息将编码PBP3的基因从铜 绿假单胞菌CMCC 10104中克隆出来，克隆出来的基因和GenBank数 据库中报道过的其他PBP3基因序列进行对比，不同之处是实验的条 件优化了蛋白的表达。带有Ni2+- NTA琼脂糖的固定化金属亲和色谱 层析(IMAC)法用于纯化重组蛋白PBP3，纯

7、化的PBP3蛋白的活性通过 青霉素结合实验来测定。材料和方法细菌、质粒、酶、试剂和培养基：菌株P. aeruginosa CMCC 10104是从中国的菌种保藏中心获得，大 肠杆菌DH5a用于载体的转化，E. coli BL21 (DE3)用作蛋白表达的宿主 菌，质粒pMD19-T和pET44b分别用于T-A克隆和蛋白质的表达。限 制性核酸内切酶、T4DNA连接酶和Taq DNA聚合酶都是购于Takara (Japan).分子生物试剂盒和IMAC等仪器试剂都是来源于 BIO-RAD (USA).其他的分析试剂都是购于上海生工试剂公司。大肠杆菌通常培养在LB培养基(10 mg/mL trypto

8、ne, 5 mg/mL yeast extract, 10 mg/mLNaCl)中，37C、振荡培养，当菌株中转入 了 pMD19-T或pET44b (+)时，应在培养基中加入100 ug/mL氨苄青霉 素。为了使克隆基因过量表达，将菌株在2倍的YT培养基(16 mg/mL tryptone, 10 mg/mL yeast extract , 5 mg/mL NaCl.）中培养。PBP3基因的克隆：P. aeruginosa CMCC 10104的染色体DNA从过夜培养的菌液中得 到，并用于编码PBP3基因的PCR扩增的模板，根据P. aeruginosa PAO1 的 ftsI基因来设计引物

9、，引物如下：5 CGcatatgGACCTGCACGTGATCGACCA TActcgagGCCACGCCCTCCTTTTGCG 3(anti-sense primer,containing Xho I digestion site).ftsI 基因的平末端省略了编码疏 水前导肽的基因，用这个引物进行扩增，起始的变性温度为94C, 5min, PCR反应是由Taq DNA聚合酶完成的，每次循环的条件如下： 变性：94C，30s 退火：63C，30s 延伸：72C，1.5min。最终 的延伸过程：72C ，10min，循环30次。扩增的产物用1%的琼脂 糖凝胶电泳进行纯化并插入到PMD19-T载

10、体中，获得的重组载体 PMD19-T-PBP3转入到感受态细胞E. coli DH5a中，并加以测序确定 核苷酸同源性。正确的重组质粒PMD19-T-PBP3被Nde I and XhoI酶 切，PBP3基因片段被提取出来并且正确地连接到质粒pET44b (+)DNA 上。这个重组质粒被命名为pET44b-PBP3，然后转入到E. coli BL21 (DE3).中。各自的结构从转化子中分离出来，并且通过限制性核酸内 切酶Nde I和Xho I的酶切后将正确大小的插入片段筛选出来。他 们再一次被测序确认核苷酸同源性。最终的结构将PBP3基因结合到 带有组氨酸标记的质粒上。重组PBP3 (rPB

11、P3)的表达：具有pET44b-PBP3重组载体的E. coli BL21 (DE3)的单个菌落接 种在含有5ml LB培养液、100 ug/mL氨苄青霉素的15ml的离心管中 培养。种子培养液接种在摇瓶中，在37笆、200 rpm条件下过夜培养。 这些细胞再接种到含有100ml的2 _ YT培养基、100 ug/mL氨苄青 霉素的500ml的摇瓶中培养。在37C下震荡培养4h,浓度为2mM异丙 基顼-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加到培养液中，诱导蛋白的表达。诱 导培养3h后，通过8000 rpm的转速进行离心收集细胞，并且通过 SDS - PAGE进行分析。去改善蛋白的表达，通过改变发酵的

12、温度、诱导时间、诱导物的 浓度等不同的条件来试验。改变的条件如下:温度为37C或者25C， 诱导时间分别为1 h, 2 h, 3 h, 4 h、5 h，诱导物的浓度为0.5 mM到4 mM.通过SDS - PAGE来分析蛋白表达的水平。大规模蛋白的生产：大规模重组蛋白的生产过程是：首先将单菌落接种到含有 100 lg/mL氨苄青霉素的25ml的LB培养基中培养，再将种子液接种 到摇瓶中37C. 200 rpm下过夜培养。最后将过夜培养的种子液接种 到2.5L的发酵罐(含有1.0L的2 _ YT培养基、100 lg/mL氨苄青 霉素)中培养。培养到菌液的OD600 nm =0.6。添加2 mM

13、IPTG进行 诱导表达，细胞菌体进一步在37C下培养3h。通过离心收集菌体细 胞(8000 rpm, 4 _C, 15 min),并且储存在-20C条件下。重组蛋白的纯化：将结冻的细胞进行解冻，取8g的菌体细胞用200 mL裂解缓冲液 （20 mM磷酸盐缓冲液，Ph7.0）重悬，用超声破碎法将细胞破碎。裂 解液在12,000 rpm、4C条件下离心10min。将上清液储存在4笆中， 并通过0.45 um滤膜进行过滤纯化。Bio-Rad NGC 蛋白纯化系统和 Bio-ScaleMini Profinity IMAC（固 定化金属亲和色谱）用于重组蛋白rPBP3.的纯化。整个纯化的过程 流速设定

14、为2 mL/min。首先，用2体积的水和5体积的裂解缓冲液 冲洗填充柱，然后将3035ml的过滤上清液装株，接着用5体积的裂 解缓冲液（含有520mM咪唑去除受污染的蛋白）洗脱，最后，用洗 脱缓冲液（20 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0, 0.5 M NaCl and 0.25 M咪 唑）.将rPBP3从柱上洗脱下来。大的碎片通过SDS - PAGE来分析，包含了高浓度的rPBP3的碎片 被合并，并且用50体积的20mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行反向透 析，4C、6h。为了脱盐，这个透析步骤需要重复两次。接下来进行 离心（12,000 rpm、10 min、4C）将聚合物去除。通过浓缩

15、器 将这些蛋白质进行浓缩并用于分析。（SDS - PAGE） 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：分子量大小、表达水平、重组蛋白的浓度由SDS - PAGE进行分析 确定。在每个凝集凹槽中添加10ul的样品，电泳结束后，用考马氏 亮蓝R-250对胶体进行染色，然后用混合液（醋酸：甲醇:水=10:25:65, v/v/v）进行冲洗。蛋白质浓度的测定：Bradford方法用于测定蛋白质浓度，在595nm的波长处读取吸光 值，牛血清蛋白被用作标准曲线的制备。Western-blot 分析：Western免疫印迹法分析和先前所描述的基本一致，以1:1000 的稀释比例的抗组氨酸单克隆抗体作为第一抗体，以

16、1:2000的稀释 比例的抗-兔的免疫球蛋白G和辣根过氧化氢酶结合到抗体上作为第 二抗体。DAB被用作检测试剂。青霉素结合的活性：通过SDS - PAGE来分析纯化了的rPBP3，从而检测青霉素结合的 活性，35C，15ul纯蛋白样品和5ul的BOCILLIN 一起孵育2h，SDS -PAGE样品缓冲液被添加到蛋白质样品中，并在电泳之前煮沸10min， 不含蛋白质的样品或用青霉素标记了的样品作为空白对照。 rPBP3-BOCILLIN混合物的测定是通过胶体在UV290nm的波长来完成 的。结果：PBP3基因的克隆和分析P. aeruginosa CMCC 10104的染色体DNA被用着编码PB

17、P3蛋白 基因的PCR扩增的模板，根据P. aeruginosa PAO1的ftsI基因来 设计克隆的引物，ftsI基因的平末端被扩增，这个平末端省去了编 码疏水前导肽的序列。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳来鉴定，结 果如图1(lanes 1-3)所示。扩增产物的长度为1500 bp 2000 bp, 这与PBP3的理论长度(1635 bp).相一致。扩增的片段被提取并连接到PMD19-T载体上，这个重组载体导入 到感受态细胞E. coli DH5a，并通过限制性核酸内切酶酶切确定， 并加以测序。用Nde I、Xho I双酶切得到的两个片段包含了 PBP3 (1635 bp)和 pMD19

18、-T simple (2692 bp, lane 4 of Fig. 1).基因测序结果如图2所示，结果表明了插入的序列是正确的，克 隆DNA的核酸序列和P. aeruginosa PAO1的ftsI基因序列相似度达 到了 99.76%这里有四个不同的碱基(66 C-A, 1020 T-C, 1233 T-C, 1527 T-C)。然而，至于氨基酸的序列，和他们是没有差别的。正确的重组质粒pMD19-T-PBP3被Nde I、Xho I酶切.PBP3片 段被修复并插入到pET44b (+)质粒DNA上，这个重组质粒被命名为 pET44b-PBP3 (Fig. 3)并转入到 E. coli BL

19、21 (DE3).单个的结构被 分离和验证，用Nde I和Xho I双酶切后产生了两个片段，他们分 别是 PBP3 (1635 bp)、pET44b (+) fragment (5495 bp, lanes 5 -7 of Fig. 1).DNA测序的结果也表明插入片段的基因序列和预期 的结果是一致的，重组表达的载体被构建后，经过实验证明是正确的， 这也为表达重组蛋白做好了准备。重组蛋白PBP3的表达具有pET44b-PBP3重组载体的单菌落被用于重组蛋白PBP3的生 产，克隆基因的过量表达，种子培养液在2 *YT培养基中培养，用 IPTG诱导物诱导之后，离心收集菌体，通过SDS - PAGE

20、进行分析， 分析结果如图4, PBP3蛋白的理论分子量为60kDa，经IPTG诱导后， 出现了一个新的蛋白，分子量大约也为60 kDa。这个结果表重组PBP3 蛋白成功表达。为了提高蛋白的表达，通过改变不同的条件来进行实 验，如：改变发酵温度、诱导时间、诱导物IPTG的浓度。最终我们 得到最优的表达条件是：37 _C for 3 h by 2 mM IPTG.蛋白质的大规模生产将优化的表达条件应用于大规模的蛋白生产，在优化的条件下， 细胞的湿重产量是8 0.5 g/L。rPBP3主要以溶解状态存在于细胞 裂解液的上清液中(see lane 5 of Fig. 5).，同时，少部分的rPBP3

21、存在于球形碎片中，因而不能被额外的超声处理而去除，(see lanes 3and 4 of Fig. 5)这表明是由包涵体导致的，而不是没有充分的裂 解。企图使用不同的洗涤剂去增加重组蛋白PBP3的可溶性。(e.g., Tween 20 and Triton X-100),但是都没有成功，降低大肠杆菌的培 养温度也没有增加可溶性蛋白的量。rPBP3的纯化细胞裂解液的上清液部分被用于重组蛋白的纯化，然而，在4C 时可溶性rPBP3的部分上清液趋于沉淀，这些沉淀的蛋白在纯化之前 必须通过离心或者经过注射器过滤器而去除，将过滤后的上清液进行 装柱，再用含有5-20 mM咪唑的裂解缓冲液冲洗将污染的蛋

22、白进行 去除，用洗脱缓冲液把rPBP3从柱子上洗脱下来，再用SDS - PAGE分 析，将含有高纯度的rPBP3的液体进行收集并合并在一起。结果如图 5所示，结果表明获得的高纯度的蛋白纯度达到了 95%，分子量大约 为 60 kDa.蛋白的测定在4C时，用20mM磷酸缓冲液对纯化的rPBP3进行反向透析， 达到脱盐的目的，接着离心(12,000 rpm for 10 min)去除聚合物。 用磷酸缓冲液透析结果使rPBP3沉淀，通过离心和浓缩，将蛋白质浓 缩，Bradford方法来测定蛋白质，纯化的结果如表1所示。最终纯 化得到的 rPBP3 是 48 mg/L (6 mg/g wet weig

23、ht cells).重组蛋白rPBP3的鉴定Western-blot用于蛋白质的进一步的鉴定分析，兔的抗组氨酸单 克隆抗体和羊的抗兔的免疫球蛋白G分别被用作第一和第二抗体，通 过DAB的测定，一个新的蛋白条带大约为60 kDa(如图5 )青霉素结合活性纯化的rPBP3用于青霉素结合活性的测定，结果如图5所示。 纯化的rPBP3能够结合到BOCILLIN FL,用荧光标记的青霉素。这个 发现表明了获得rPBP3是由功能的，通过C-端组氨酸标记的存在表 明了它并没有阻碍它结合青霉素的能力。讨论P. aeruginosa是一种典型的铜绿假单胞菌属，是人类和动物的 主要条件致病菌之一，细菌学的研究分析

24、结果表明在不同的医院都有 假单胞菌属，主要是铜绿假单胞菌，从医院里感染革兰氏阴性细菌的 病人的血液、唾液以及其他的临床资料中度可以分离到这些细菌，铜 绿假单胞菌的存在还与病人的囊胞性纤维症并发症有联系的，或者是 外科、创伤、灼烧等有关，铜绿假单胞菌被认为是第二大最频繁的病 原体在外科手术中，在医学界是第三。因此，迫切需要去发现一些方 法去控制它的感染。P. aeruginosa CMCC 10104是典型的菌株，在中国广泛使用，然 而，对于它的基因组学和蛋白质组学还没有研究过。在本研究中，根 据P. aeruginosa PAO1的ftsI基因，编码PBP3蛋白的基因从P. aeruginos

25、a CMCC 10104克隆出来，ftsI基因的平末端省去了编码 疏水前导肽的序列，这些基因通过PCR进行扩增，来自P. aeruginosa 的PBP3蛋白和对应的来自大肠杆菌中的蛋白的相似度达到了 42%， 在本研究中，克隆的DNA和来自PAO1的ftsI基因序列的相似性达 到了 99.76%，仅有四个碱基不同(66C-A, 1020 T-C, 1233 T-C, and 1527 T-C).然而，然而他们推导出的氨基酸序列却没有区别。对产自P. aeruginosa的PBP3蛋白的研究是很少的，在以前的 一些研究中，编码的PBP3蛋白的ftsI基因是从PAO1克隆出来的， 并且在E. c

26、oli BL21 (DE3)表达，然而，这些方案中，PBP3的产量 (0.01 mg/L)也是非常的低，最终纯化的蛋白质的量只有1.1 mg， 在本研究中纯化的蛋白质的量为48 mg/L，rPBP3产量的提高来源于 跨膜螺旋的去除，另一方面，小部分的rPBP3存在于小球当中，也不 能通过超声进行去除。这表明存在于包涵体中，而不是因为破碎不充 足，通过使用不同的清洁剂来增加蛋白的可溶性，结果也没有成功， 降低表达菌体的培养温度也没有增加可溶的rPBP3.总之，铜绿假单胞菌是动物和人类主要的条件致病菌之一，P. aeruginosa CMCC10104是典型的培养菌株且在中国广泛使用，然而， 它们的基因组学和蛋白质组学并没有研究过，在本研究中，编码PBP3 基因是从P. aeruginosa CMCC10104克隆出来的，这里所描述的方法 来获得纯化的重组PBP3，这个纯化的蛋白可用作一个受体，去检验 抗菌剂产生的化合物的结合力。这个研究有助于进一步研究新的抗菌 剂，主要针对人类重要的致病菌。