WB-自己总结

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1、W实验环节1. 组织样品制备 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50100m加m裂解液,肺10020m加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，迅速匀浆。裂解后，将裂解液移1.5l 离心管中,（若有组织残渣可继续冰上振荡0mn)；然后4、rpm离心in,取上清分装于0.ml离心管中并置于-0保存（-80长期保存)。g离心，4，2mi。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充足混合沉淀加ading buf后直接上样最佳,剩余溶液(溶于1loadig buffer）可以低温储存，-70一种月，-20一周,4 1天,每次上样前98，3min。2. 蛋白定量2.2.制作原则曲线（1）从

2、20取出浓度为gl 的BSA(牛血清白蛋白,蛋白原则品），室温融化后，备用，使各个孔的终体积为20。BS浓度(g/)0.025.050.1000.003000.4000.0BSA（l)0242160PS（l）201918612840BSA含量(g)0051210(2）根据样品数量(每样0L)，按50体积CA试剂+1体积BCA试剂B(50:1）配制适量 BCA工作液,充足混匀（刚开始混合时也许会有浑浊，但混匀后浑浊就会消失,BCA工作液在室温24小时内稳定);(3）向各孔中各加200lBCA工作液;(）迅速把酶标板放在震荡器上震荡30s混匀，然后37孵箱孵育mn,然后在 52nm 下比色测定，以

3、蛋白含量(g)为横坐标，吸光值为纵坐标,绘出原则曲线；2.2蛋白样品测定(1)一方面将样品做一定比例稀释（最佳测定前多做几种梯度，一开始可稀释10倍:Prein/PBS=2/L）,以拟定好最佳样品浓度；(2)将稀释好的样品加入到96孔板中,使样品稀释液总体积为20L，每个浓度反复2-3次;(3）加入A工作液200，充足混匀,3孵箱孵育30分钟(注:若使用温箱孵育时,应注意避免水分蒸发)；（)以原则曲线0号管做参比,用酶标仪测定5nm处的吸光度值;(注:由于移液器在取小量时的误差较大，原则线前面的点也许不是很精确,因此尽量的让样品点落在原则曲线的后1/2部分)；（）根据所测样品的吸光值，在原则曲

4、线上即可查得相应的蛋白含量(）,除以样品稀释液总体积(20L)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位:/L）。3.蛋白样品上样前解决（1）一方面，调节蛋白样品的浓度,使各个实验组、空白组和Model组蛋白浓度保持一致，并使其在后续的上样中,每孔样品所含的蛋白总抽提物在2-40左右;（2)蛋白变性:5上样缓冲液20L+1二硫苏糖醇(T)0L+适量纯水统一成浓度为1 g/L的蛋白样品混匀;(3)样品混匀后,PR仪上98变性5in(或70加热510in）,简短离心，取上清，-2 短期或70长期保存。3 蛋白电泳31制胶(聚丙酰胺凝胶,AGE胶)聚丙酰胺凝胶PAG电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白,AG

5、E胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr)和N，N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及MAP 或EMD,凝胶为中性、水溶性、三维网状构造。凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T)和交联度（C) ,T%=(a+b)/m*00; 和C%=a(a+b)*1%,其中：a=双体(bis)的重量;=单体(arc)的重量；=溶液的体积(ml)。丙烯酰胺总量增长，则孔径减小，5%C构成最小的孔径,任何的%C增长或减少,孔径都增长,凝胶的百分浓度构成需两个参数，丙烯酰胺（acr)和,-甲叉双丙烯酰胺(Bs).的总量百分浓度(w/v)。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度(参照下表)，原则上

6、高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。蛋白分子量(ka)凝胶浓度()40214150-702.51-1001025-2008（1）玻璃板蘸洗洁精轻轻擦洗,用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里烘箱烘干;(2)玻璃板对齐后放入夹中卡紧,卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。(3）分离胶（10） 1块 2块超纯水308ml6.6l3%cr/B2.475m49ml 1.5 mol/Tis HCl(pH8）.875ml375l1%SDS75l5l10P（过硫酸胺）37.5l7 TEMED 3.75.5 l、加 TEMED后立即混匀灌胶：迅速在右上角斜灌（注：可用10ml

7、枪吸取5ml胶沿玻璃放出。最后几滴不注入以免产气愤泡),使胶面与把手齐平。、灌胶后立即加水，枪平放，迅速均匀缓慢注水(注:灌胶时开始可快某些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡;加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型）。c、当水和胶之间有一条折射线时，阐明胶已凝了。再等mn使胶充足凝固,就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（4)浓缩胶(4） 试剂 用量H2O 27m30%A/Bs 0.67mL1.5 Tris/HCl（P 8.8） .m10%SS 0.04mL% S 0.mLEMED 0.4m浓缩胶配好后迅速沿右上角灌封，迅速插入梳子(水洗晾干),水平插

8、入后等1h(注:由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,因此在浓缩胶凝固的过程中要常常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出）。3.电泳 (1)给灌好的胶上方梳子部分冲少量双蒸水，然后双手对称轻轻将梳子拔出,再用蒸馏水冲洗梳孔,将孔内水分排净。将夹子松开取出玻璃板放入电泳槽中(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外；若只跑一块胶，另一边需垫塑料板)。先向两块板间注入1 电泳液至玻板上缘，然后电泳液在外盒亦加1/4;(2）测完样品蛋白含量后，计算含2040g蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入 SDS上样缓冲液至终浓度为1SD

9、S(注:上样总体积一般不超过15，加样孔的最大限度可加30 样品);(3）样品混匀后PC仪5加热5min，迅速冰上冷却, 130s 瞬时离心;（4）上样:用微量进样器吸取样品，插入加样孔缓慢加入,避免样品溢出(加下同样品前在电泳液中洗涤3次，避免交叉污染）；注:a、插入加样孔缓慢加入，避免样品溢出;加下同样品前在电泳液中洗涤3次，避免交叉污染;b、样品体积=（20-0g)/蛋白浓度，局限性部分以裂解液补充；c、显影Marke(红色）2 3l（上样buffer)；（5）电泳：盖好电极盖（红-红,黑-黑),设立为恒压0,电泳约 3min,各样本跑至积层胶末端(浓缩胶和分离胶的分界面）后,调节电压至

10、160V，继续电泳约0in,待溴酚蓝前沿距电泳槽底部1cm时,停止电泳。2. 转膜2.1 准备(1）转一张膜需准备6张7.083c的滤纸+1张7.38.6c的硝酸纤维素膜;注：a、切滤纸和膜时一定要戴手套,由于手上的蛋白会污染膜；b、将切好的硝酸纤维素膜置于纯水浸2才可使用，操作措施是:用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上，只有下层才与水接触,这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿,若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会制止膜吸水)；(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；（3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫

11、，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动);25.2转膜(1)裁剪2张同等大小的转膜专用滤纸和4张纱布：将2张纱布、张滤纸浸泡于PH0.4的Ande buffer中；将张滤纸浸泡于H0.4的Anode uffer中;将6张滤纸和2张纱布浸泡于PH.的Gathde buffer中;将凝胶从电泳槽内取出，切割至合适大小并剪角标记，先浸泡纯水0秒,再浸泡在H9冰冷的Gatho buf中孵育5mn;将PVF膜，先放入2%甲醇中浸泡活化1-2min,再于冰冷的电转液中浸泡至少5min;（2）切胶：要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬，撬一

12、会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂)。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调节使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动)并除气泡。（3）按照如下顺序：正极板、纱布1张、滤纸2张、滤纸1张、PDF膜（剪角标记)、凝胶、滤纸张、纱布1张、负极板，整洁叠放，小心清除叠层中的气泡;(）将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用60转移2 h或4 转移3 h(注：视目的蛋白分子量大小拟定转膜时间,可做

13、预实验摸索经验）；（5）丽春红染色(观测膜的转移状况）：将PVDF膜放入TST 洗一次，再置于1:稀释后的丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5mn,倒回染液；用大量的蒸馏水浸泡膜(或用甲醇冲洗，条带会更清晰),直至水变清，无色蛋白条带清晰(注：膜可以用 TBT 或水重新洗后再进行染色；PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭)； 2.6封闭为避免一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。老式上有两种封闭液:脱脂奶粉或BA,脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（注：因脱脂奶粉具有酪蛋白，该蛋白自身就是一种磷酸化蛋白;使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背

14、景;某些抗体用 BSA 封闭时因不明因素也许会产生比脱脂奶粉更强的信号,请仔细阅读阐明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭措施)。将 PDF 膜条放入盛有约 2m%封闭液的小盒中（膜正面朝上）,盖上盖子,室温水平摇晃4 rpm,封闭2h。2.7 一抗孵育（1)孵育 Buffe的配制：按阐明书建议的稀释倍数，用过滤除菌后的ST 稀释一抗到合适浓度（GAPDH为:1000）,如果阐明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(:100-1:300），一抗浓度过高会导致产生非特异性条带；某些实验室老式上在封闭液中孵育抗体,而有些实验室用不具有封闭剂的TBST孵育,成果因抗体而异,有时两者成果相似，有

15、时不同；（）孵育：TBS/溶液洗去膜表面多余的封闭液，每块加入S/T溶液0mL，摇荡95 rp，m3次。按照预染彩色蛋白Marker的分子量批示条带拟定目的蛋白位置,把VD膜剪成2条条带（目的蛋白和内参条带),立即完全浸泡于相应的一抗反映液中。4摇荡4rp,过夜（一抗回收后可加入 10叠氮钠 2中多次运用)。注：a、孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜不等,具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度,建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的的孵育时间来保证特异性结合；、孵育温度：如果在封闭液中孵育过夜,应在4进行,否则污染会导致蛋白降解（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持合适的摇动使之均匀覆盖膜，

16、避免结合不均匀。. 二抗孵育(1) TBST 洗膜：洗涤过程中放于摇床水平摇晃,摇荡95 rpm,5min3次;(2)孵育；按阐明书推荐的倍数稀释二抗，如果阐明书没有标出稀释倍数,则按常规的倍数稀释(1:1000 - :20,00)预实验，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带，室温振荡2h;(3) TB水平摇晃洗膜3次，每次至少5mi；再用TBS 洗一次,0min;准备进行 CL 显色。2. CL显影() 物品准备:移液器、薄塑料袋、胶带、剪刀、镊子、枪头、曝光夹、废液缸、手套、 管、X-光胶片底片(密封避免曝光）、PF 膜、L 液、大平皿、大饭盒、水槽、将曝光夹、薄塑料袋、胶带事先准备好；（2

17、)配ECL 液：A、液等量1:1混合,吸完液再吸液时一定要换枪头,否则会导致污染,使试剂失效;1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充足接触;min 后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液，包好,放入 X-光片夹中。(3） 显影和定影：在暗室中,将1显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出 -光片,用切纸刀剪裁合适大小（比膜的长和宽均需大1c);打开 X-光片夹,把X-光片放在膜上，一旦放上,便不能移动,关上 X-光片夹,开始计时；根据信号的强弱合适调节曝光时间，一般为 1-m,也可选择不同步间多次压片，以达最佳效果;曝光完毕后，打开 X-光片夹,取出 X光片，迅速浸入显影液中显影,待浮现明显条带后,即刻终结显影。显影时间一般为30n(025），温度过低时（低于6)需合适延长显影时间；显影结束后，立即把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 510mi ,以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。注:显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对成果产生影响。.0灰度扫描X光胶片在凝胶自动成像仪上进行照相、数据分析。经凝胶密度扫描系统解决，测定各信号带灰度值。以内参GDH的蛋白信号灰度为内参照，计算待测蛋白的信号灰度值与它的灰度比值，作为待测蛋白的体现值。即:待测蛋白相对量=待测蛋白信号灰度值/PD蛋白信号灰度值。