最新PCR的发明原理及应用(共18张PPT课件)

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1、PCR的发明(fmng)、原理及应用第一页，共十八页。PCR的发明(fmng)Kary B.Mullis，在，在Cetus公司公司工作期间，发明了工作期间，发明了PCR。他原他原本是要合成本是要合成DNA引物来进行测引物来进行测序工作，序工作，却常为没有足够多的却常为没有足够多的模板模板DNA而烦恼。而烦恼。1983年春夏年春夏之交的一个晚上，他开车去乡之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上下别墅的路上(l shng)萌发了用萌发了用两个引物（而不是一个引物）两个引物（而不是一个引物）去扩增模板去扩增模板DNA 的想法的想法第二页，共十八页。nDNA双螺旋结构于1953年发现 n第一个细胞内用

2、来复制DNA所需的聚合酶于1956年分离(fnl)成功n自1970年代起，由于发现选择性切割DNA分子的限制性内切酶及接合酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展 第三页，共十八页。1983年春，年春，Mullis发展出发展出PCR的概念；的概念；1983年年9月，月，Mullis用大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个实验，只用一个循环；循环；1984年年11月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了10个循环后的个循环后的49 bp长度的长度的第一个第一个PCR片片断；断；1985年年12月月20日，日，Mullis的同事的同事Sai

3、ki在在Science上发了一篇论文，方法中用上发了一篇论文，方法中用(zhngyng)了了PCR技术，导致技术，导致Mullis的文章到处被拒；的文章到处被拒；1985年年10月月25日申请了日申请了PCR的专利，的专利，1987年年7月月28日批准（专利号日批准（专利号4,683,202），这回），这回Mullis是第一发明人。是第一发明人。1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的的方法；方法；1986年年6月，月，Cetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq D

4、NA polymerase，这，这是是86年春天年春天Mullis建议做的；建议做的；1988年，第一台年，第一台PCR仪问世；仪问世；1991年，年，Hoffman LaRoche以以3亿美元的代价从亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发公司获得全权开发权。权。第四页，共十八页。PCR的原理(yunl)nPCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：n1.模板DNA的变性：即在高温（93左右）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；n2.模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合(jih)；n3.引

5、物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的53方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。第五页，共十八页。nPCR反应五要素反应五要素(yo s)：即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板、和Mg2+。第六页，共十八页。n（一）Mg2+:终浓度为1.52.0mmol/L，其对应(duyng)dNTP为200 mol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq DNA聚合酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mm

6、ol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。第七页，共十八页。n（二）dNTP：dNTP具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般(ybn)存储浓度为 10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。n（三）Taq DNA聚合酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7075，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。某

7、种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.55个单位/100l。第八页，共十八页。n（四）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。n（五）引物：引物浓度一般为0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用(xunyng)A、C、G（因T错配也

8、能引发链的延伸）。引物G C约占4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。第九页，共十八页。PCR常见问题1、模板原因、模板原因 纯度：含有抑制(yzh)物 浓度：含量低or太高 第十页，共十八页。2、引物原因、引物原因 引物错误 引物设计(shj)不好 引物合成、纯化不好 第十一页，共十八页。3、PCR条件条件(tiojin)原因原因 退火温度 延伸时间 循环次数第十二页，共十八页。4、非特异性扩增或拖尾、非特异性扩增或拖尾第十三页，共十八页。引物特异性差 模板和引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火(tu hu)温度

9、偏低 循环次数过多第十四页，共十八页。PCR的应用(yngyng)n 基因、DNA片段的克隆n人工基因构建nDNA序列测定n基因定点突变n基因型（突变）检测nSNP分析，遗传背景分析n生物物种(wzhng)鉴定，系统进化研究第十五页，共十八页。n疾病基因检测/遗传病的产前诊断n致病病原体的检测 n肿瘤治疗(zhlio)中癌基因的检测nDNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 n其他:动、植物检疫（转基因动植物检测）第十六页，共十八页。PCR技术(jsh)n巢式PCR和半巢式PCR(nested primer PCR)n多重PCR(multiple PCR)n不对称PCR(asymmetri

10、c PCR)n锚定PCR （anchored PCR)n反向PCR（inverted PCR)n彩色PCR（color complementation asay)n原位PCR（in situ PCR）n差异显示PCR（differential display PCR）n重组PCR（recombinant PCR）n增敏PCRn定量PCR（quantified PCR）n荧光实时(sh sh)定量PCR技术第十七页，共十八页。内容(nirng)总结PCR的发明、原理及应用。1984年11月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。DNA指纹、个体(gt)识别、亲子关系鉴别、法医物证。荧光实时定量PCR技术第十八页，共十八页。