溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响

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1、溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响来源:中国论文下载中心- 作者：潘春燕,谢春英,王燮衡，王爱琴【摘要】 目的 理解用实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DA拷贝数时，溶血对乙型肝炎病毒DN定量检测的影响。 措施 采集30例乙型肝炎患者血液,分离血清,置于-2冰箱保存备用,并同步配制出含不同浓度b血清管。采用实时荧光定量R措施,检测含不同Hb浓度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷贝数,用配对检查进行记录解决。成果当标本中Hb浓度不不小于32 g/L时，Hb对检测血清乙型肝炎病毒NA拷贝数无明显影响（P0.05）。结论 当Hb浓度较低时，b对血清乙型肝炎病毒DA定量检测无明显影响,因此较低浓

2、度溶血标本可以进行乙型肝炎病毒DA的定量检测。【核心词】乙型肝炎病毒;N定量;溶血;PCR 血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判断乙型肝炎病毒在体内与否复制,患者传染性高下及选择治疗方案的重要指标。目前临床一般采用实时荧光定量PCR技术对乙型肝炎病毒DA拷贝数进行定量检测。实时荧光定量PC技术融汇了PR技术的高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性等长处，通过直接检测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的成果。但此技术也许与标本状态密切有关,如溶血、脂血等。有研究表白Hb及其代谢产物也许与aq酶互相作用,进而克制Taq酶的活性，使PR扩增效率明显减少，导致定量测定成果偏低。在临床检查标本中

3、，溶血标本较为常用，究竟溶血到何种限度会对乙型肝炎病毒DN定量成果产生影响？本文将探讨不同限度溶血对乙型肝炎病毒DNA定量检测的影响。对象与措施 .对象 我们收集了T0UL、HsAg阳性、BAg阳性、BA阳性的乙型肝炎患者30例,其中男性1例,女性1例，年龄在5岁之间。 .试剂 深圳匹基公司提供的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒（批号:050)、乙型肝炎病毒DA阳性原则品。 3.仪器 BCMA全自动血球计数仪（型号:ulter Ac.Tdiff）、Lighycl荧光PCR扩增仪(罗氏公司）、高速低温离心机(iga公司）、干式恒温器（杭州蓝焰科技有限公司）、低温冰箱(SAYO公司)。 4 措施 （1

4、）模拟溶血标本的制备：抽取30例乙型肝炎患者血液后,2小时内离心分离血清,这种不含Hb的血清作为无Hb对照组，然后取每位患者60l血清及适量红细胞混合,置于-2冰箱保存备用。次日将含红细胞的血清管取出放于室温解冻，完全解冻后再将该管置于-2冷冻，如此反复冻融两次,使得RBC完全破裂,释放出b。在Cou全自动血球计数仪测定每管红细胞裂解后的H浓度,再用每位患者的血清稀释,使得b终浓度为4 g/L、8 g/L、6 gL、2 gL,这些标本即为模拟溶血标本。 （2）乙型肝炎病毒DN模板制备：取待测样本及阴、阳性对照（试剂盒备有）各00 l，分别加入到5 l的离心管中，再分别加入10l NA提取液1，

5、震荡混匀，00m离心0 in;吸弃上清液,再加入25 l提取液2，震荡至沉淀完全散开，100干浴1 i；冷至室温后，13000离心10 in，保存上清液备用。（3)PR扩增:从试剂盒中取出乙型肝炎病毒DNA扩增反映液、Taq酶及NG,室温融化后按规定比例混合均匀,根据试剂盒阐明书配备反映液,分装于Rche毛细扩增管中,每次实验均设2管阴性对照，管强阳性对照,1管临界阳性对照， 4管乙型肝炎病毒阳性工作原则品，其拷贝数分别为5.0104、5.00、5.0106、5010拷贝/l，将上述对照及样本各加2l于加好反映液的oche毛细管中，短暂离心后上机扩增。对检测成果高于5.0107拷贝/ml的标本

6、进行稀释后再扩增,使其成果落在试剂盒检测线形范畴内。 （4)核酸扩增与荧光数据采集:扩增条件设立为7孵育3分钟； 4变性分钟;再进入40个循环,每一种循环涉及9变性秒，0退火及延伸0秒,在60时单点收集荧光信号;仪器检测通道选择F1通道。 （5)分析条件设定:选择F1通道，点击uaniicton进入定量分析窗口，设定Analysis方式为prprtona,选定Nois bak项，阈值选定为刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点,且t值不浮现任何数据为准。 （)数据分析：四个阳性原则品Ct值均须不不小于3.0,原则曲线的拟合度须不不小于-098，阴阳对照品扩增须符合预期规定，得出的待测样品的拷贝数才

7、为可信成果。 5.记录学解决 将测得的乙型肝炎病毒DN拷贝数转换成常用对数,再运用SPS软件包进行记录，各含b的血清组与无H的血清组间差别采用配对t检查进行差别性检查。 成果为4、8、16、及32 gL的血清组中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与无b的血清组分别进行配对t检查,值均不小于05，因此每一组含H的乙型肝炎病毒DA拷贝数与不含Hb的血清组均无明显性差别。见表。表1 各组乙型肝炎病毒NA拷贝数及记录量（略） 讨论 实时荧光定量PR技术检测乙肝病毒DNA已在临床广泛使用，但在临床应用中,影响的因素也较多，如实验室条件，操作人员的技术，临床标本的状态等。某些研究觉得溶血标本对FPC技术检测乙肝病毒

8、DA有影响,但也有研究觉得这种影响并不明显2。本文通过模拟不同限度溶血标本,觉得溶血达到32 gL对检测成果无明显影响(P0.05)。陈英剑等觉得溶血至2 L时对检测成果无影响，这与本文研究结论基本一致。 本文将乙型肝炎患者抽血后2小时内分离的血清作无b对照组，然后通过反复冻融使标本溶血,再用乙型肝炎患者自身血清稀释以获得不同b浓度溶血标本,在模拟不同限度溶血标本过程中,不添加任何外来物质，使检测成果受外在因素影响限度减少到最低。实验成果经记录解决后，发现溶血限度控制H的浓度在32/L如下时,对乙型肝炎病毒D的检测成果无明显影响（0.5)。浮现此成果的因素也许有两个方面，一是在BDNA模板的提

9、取过程中,标本中的H经10煮沸1分钟后已经变性沉淀,再经离心后,待测样本上清液中也许不会有Hb的存在，仅剩Hb的衍生物4。并且随着提取措施的不断改善,提取液中对DN聚合酶的干扰物质不断减少，清除H越来越彻底。另一方面FQPCR对乙肝病毒DNA定量检测只是一种半定量措施,并不是对扩增后终产量进行完全定量，它是根据样本可检测的起始扩增时间与原则品扩增曲线得出的半定量成果。本文收集的0例病人的血清中HBVDNA含量均不小于107拷贝ml,样本中HBNA含量较高，血清中DNA含量不不小于107 拷贝/ml时,检测成果与否有差别，尚需进一步研究。且本文只对溶血限度不不小于32L时进行探讨，溶血不小于32

10、gL时对检测成果的影响,也需进一步验证再作结论。溶血限度达到32 /L时已是肉眼非常清晰可见，临床溶血样本的溶血限度大多在3 g/L如下,因此我们觉得一般的溶血样本可以接受。但需注意的是，本文只是对深圳匹基公司试剂进行探讨,不同厂家,也许因使用不同的提取液及提取措施而浮现不同的结论，有文献报道,使用PE沉淀煮沸法和直接加热煮沸法提取HBVDNA所得的定量成果有差别，因此不同提取措施对检测成果有一定的影响5。一般而言厂家提供试剂时会给出较为清晰的影响试剂盒使用的多种因素，有能力的PCR实验室在试剂使用前，可进行此类评价实验，制定合适本实验室使用标本留取原则。随着卫生事业的发展,人们对检查质量的的

11、规定越来越高,但检查质量不可避免的受较多因素影响,标本质量是重要的影响因素之一,如溶血、脂血、餐前、餐后等，对各项影响因素进行量化研究，如溶血、脂血达到何限度时则定为不合格样本,都应当有明确的指标。本文只对溶血限度不不小于32 g/时进行探讨，溶血不小于32 /时及血清中BDN含量不不小于107 拷贝ml拷贝时对检测成果的影响，需进一步验证再作结论。【参照文献】 1黄 翔,王日军,周志明,等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取措施的选择与评价.华中医学杂志，28（02):13124.李金明,王露楠 样本解决对聚核酶链反映测定乙肝病毒核酸的的影响.中华检查医学杂志，,23（6):37339.3陈英剑，胡成进,齐法莲,等.溶血对荧光定量PCR检测HBVDNA成果的影响J.国外医学临床生物化学与检查学分册,25（6）：53-54. 4陈晓东,陶志华,周 武.核酸提取措施在聚合酶反映测定乙肝病毒核酸中的评价J.中华检查杂志，25(4）:212 程正江,付文荣,曾平凡.荧光定量聚合酶链反映直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸措施的建立及评价J中华检查医学杂志,，27（2）：02-03.