Western实验操作原理及方法 jst

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1、蛋白免疫印迹(Western blotting)实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)存在两种不同的颜色形式： 红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。此反应大 约2 min即可完成，并可稳定1小时。2、SDS凝胶：丙烯酰胺(Acr)和甲叉丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate, (NH4)2S208,

2、APS)或核黄素(ribofavin, VB2)和加速剂N, N, N,N-四甲基乙二 胺(N, N, N,N-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED )的作用下，聚合成三维网状结构。* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时， 所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳 迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，

3、12000rpm 1min离心，弃上清， 细胞沉淀保存于-80C。2、 把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER (Thermo,约为细胞体积的23倍)，悬浮细 胞。10 mL M-PER 或 T-PER+50yL 200 mM Na3VO4+50yL 200 mM PMSF+1 片 IN (Roche， 酶抑制剂复合物)3、 将装有细胞悬液的Doff管固定在4C层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1 小时。4、冰上，超声破碎(注意先用纯水清洗探头)， AmL=35%超声10s，停顿5s,反复10次(探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不 要产生气泡)5、重新固定在脱色摇床

4、上， 4C， 1 h， max speed。6、离心， 12000 rpm， 4C， 20 min7、吸上清于另一 Doff管中，保存在-80C。测定蛋白浓度(Bradford法)：1 、测定标准曲线牛血清白蛋白(BSA)标准液的配制：配制1mg/mL的BSA溶液，稀释成浓度梯度为 100yg/mL, 200yg/mL, 400yg/mL, 600yg/mL, 800yg/mL 的标准液。标准曲线的测定：取2吐配好的标准液加入到2mL考马斯亮蓝试剂中，室温放置5 min 以上，595nm测光吸收值，制成标准曲线。2、测定蛋白样品的浓度 取一定量的蛋白样品加入到2mL稀释好的考马斯亮蓝试剂中，室

5、温放置5 min以上，595nm测光吸收值（OD值0.8时，需要减少反应蛋白的体积）。 通过标准曲线求得未知蛋白的浓度，计算上样体积。制胶：1、分离胶 装好胶板，检验是否漏水，吸干水分。 按一定比例加入各试剂。以浓度为12%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加 入：1.87mL H2O, 3.375mL 1M Tris-HCl（pH 8.8）, 3.6mL Acr： Bis （29:1）, 90yL 10%SDS, 60yL 10%APS, 4.5yL TEMED。注：一般1.5mm厚的胶需配9mL， 1mm厚的胶需配6mL。Acr： Bis （29:1）有毒，称取时注意防护，待全部溶解

6、后用滤纸过滤，4C避光保 存。10%APS需分装在Doff管中，-20C避光保存。 混匀，用刻度吸管将混匀的凝胶溶液加到胶板中（贴壁加，避免产生气泡），然后加 1mL 水或正丁醇封住液面。 待胶凝固，将上层封胶的液体从胶槽的一边倒去，用滤纸条吸干多余水分。2、浓缩胶 按一定比例加入各试剂。以浓度为4.5%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加 入：2.17mL H2O, 0.388mL 1M Tris-HCl（pH 6.8）, 0.45mL Acr： Bis（29:1），27yL 10%SDS， 15gL 10%APS, 2gL TEMEDo注：一般1.5mm厚的胶需配3mL, 1mm厚的

7、胶需配2mL。 混匀，缓慢加入胶板中，小心插上梳子。 准备沸水浴，准备上样体系。样品制备：1、根据标准曲线和样品OD值算出样品浓度和上样体积（不宜超过50吐），用1 X PBS 补足到相同的上样体积。先加1 X PBS,再加样品和5 X loading buffer （使用前加5%BME）,混匀。2、用小夹子夹住Doff管，沸水浴中8mino电泳：1、配制 1 X running buffer 并加 SDS （SDS 的终浓度为 0.1%）。2、取下胶板上的梳子，把胶板底部打开为半开，将电泳液倒入电泳槽中，没过胶板。3、上样，动作要慢，切忌溢入旁边的胶孔，marker上4yL。4、上槽接正极，

8、下槽接负极，30mA，约1-1.5h，当溴酚蓝前沿到达胶的底部时，停止 电泳。转膜：1、准备1L transferring buffer,使用前先置于4C预冷。2、在容器中倒入适量transferring buffer,浸泡滤纸4张，海绵2 片,纤维素膜或PVDF 膜1片。3、电泳结束后，取下胶板，卸下胶框，撬开短玻璃板，在凝胶上切一小角作为加样标 志。4、将胶块的浓缩胶切除丢弃，分离胶取出浸泡在transferring buffer中。5、制作转膜三明治：负极-一层海绵-两层滤纸-胶-纤维素膜-两层滤纸-一层海绵-正极 注：胶放在负极面，整个操作在buffer中进行，赶走所有气泡。6、将“三

9、明治放入电泳槽中，倒满transferring buffer，注意电泳槽的正负极。7、电泳槽放入冰盆中，4C层析柜中转膜3小时（180mA,将电压调到最大），也可转 膜过夜。免疫杂交与显色：1、将膜取出，PBST洗膜一次。2、将膜放入封闭缓冲液中（10%脱脂奶），脱色摇床摇动 1 小时， RT。3、用PBST洗膜3次，每次5min。4、 将膜封入袋中，加一抗，赶走气泡，封口，4C摇过夜或室温下3h。 一抗置冰上，用1%BSA （溶于PBS中）稀释一抗。5、将膜取出，一抗回收，膜用PBST洗3次，5min/次。6、将膜再次封入袋中，加二抗，赶走气泡，封口，摇动1小时， RT。 二抗置冰上，用PB

10、ST稀释二抗。7、洗膜，10min/次，3次；取出ECL试剂，打开洗片机。8、 将膜放在干净的一次性手套上，正面朝上，每毫升ECL试剂加入3ML 4的过氧化 氢，混匀后加在膜上（一张2 X 6cm的膜用1mL）,反应1min。9、将膜沥掉ECL液体，移到暗盒中（正面朝上），覆上透明的薄膜，拿到暗室。10、在暗室中，取出X光胶片，压到膜上，反应1-2min （具体时间视荧光强度而定）, 送进洗片机洗片。剥离（Stripping）：1、PBST 洗一次，5min。2、加入 stripping buffer， 10min， RT。3、PBST 洗三次，5min/次。4、10%脱脂奶粉封闭。5、以下步

11、骤同上。四、试剂配制：1、30%丙烯酰胺溶液 200mLAcr 58gBis 2g注意：Acr有很强的神经毒性，操作过程中注意防护，配制中用到的器皿及污染的地 方也因及时清理。完全溶解后用滤纸过滤，4C避光保存。2、Tris-HCl, 1M，pH8.8 及 pH6.8,各 500mLTris 60.5g12N HCl，调 pH 至 8.8 和 6.8定容至 500mL3、10% APS 20mLAPS 2gH2O 20mL分装于Doff管中，存于-20 C4、5XSDS-PAGE loading buffer 10mL终浓度10% SDS5mL5%甘油2.5mL25%1M Tris-HCl，p

12、H6.81.55mL155mM溴酚蓝5mg0.5mg/mLH O0.45mL2分装后室温保存 使用前加入巯基乙醇（BME），使终浓度为5%5、10XSDS-PAGE running bufferTris30.2gGlycine144gH O 1000mL2室温保存使用时加入10mL 10% SDS,使其终浓度为0.1%6、Transferring buffer 1L10* running buffer （无 SDS）100mL甲醇200mLH O700mL27、 PBST1L10*PBS100mL5% Tween-2010mL8、10% 脱脂奶粉PBST45mLNonfat-milk 4.5g

13、五、注意事项：1、本实验中涉及的丙烯酰胺（Acr）、甲叉丙烯酰胺（Bis）、N, N, N,N-四甲基乙二胺 （N, N, N,N-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）、卩巯基乙醇（BME）、SDS，均有毒性，操作过程中注意防护，其中TEMED和BME需在通风橱内操作。2、10%脱脂奶粉和用1XBSA稀释的一抗可以重复使用，但如果发现其长菌或变质，应 立即更换。3、Running buffer 和 Transferring buffer 可重复使用最多 5 次。4、硝酸纤维素膜应避光防潮保存。六、常见问题和参考解决方案1、电泳中出现的问题：出现的问题可能的原

14、因解决的方法推荐电压条件下电 泳时间过长电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1x稀释液推荐电压条件下电 流过咼，热量过大电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1x稀释液推荐电压条件下电 流过低或无电流接触不良在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液 没过加样孔；检查导线连接蛋白带型条状（streak）上样过量，样品中盐浓度过高降低蛋白上样量，通过透析或凝胶过滤降低 样品中的盐浓度样品沉淀加大样品中SDS的浓度样品中的污染，如 脂类或DNA复合物离心或过滤样品以除去特定污染制胶不佳确保灌胶均匀，一次完成条带模糊蛋白样品部分变 性完全变性蛋白蛋白样品部分还 原确保加入足够量的DTT或卩巯基乙醇电泳时间过长

15、观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时 间哑铃形条带或“微 笑”条带上样体积过大导 致不完全堆积使用恰当的上样体积。如果样品过稀，使用 超滤浓缩电泳过程中电场不均匀如果蛋白浓度已知，上样时确保对称分离胶表面不平在制胶时使分离胶表面水平凝胶过期在指定的失效期前使用凝胶2、 显影中出现的问题：出现的问题可能的原因解决的方法反影（白色条带，黑 色背景）HRP过高（背景较高）至少成倍稀释一抗/二抗（可410倍）*注1显影后膜上条带处 变为黄色HRP过高（敏感性 太高）至少成倍稀释一抗/二抗（可410倍）*注2信号弱或无HRP过高引起底 物迅速耗竭至少成倍稀释一抗/二抗（可410倍）*注3抗体-抗原系统

16、敏 感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量*注4转膜不充分/过转优化转膜条件*注5HRP或底物活性 降低测试活性或选用敏感底物*注6高背景HRP过高（背景较 高至少成倍稀释一抗/二抗（可410倍）*注7封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好*注8抗体与封闭液有父 叉更换封闭液（如3%BSA的TBST）*注9TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量*注10曝光时间过长降低曝光时间*注11抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内有白点转膜不良（如有气精细操作*注13泡在胶-膜之间）膜平衡不均/油脂 污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜注 4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压

17、片时间比较简单，在此不赘述，只提醒一 下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积（平方毫米） 乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电 泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。（见抗体技术实验指南的免疫印迹一章），注14膜与X光片间有气 泡显影前去除气泡非特异性条带抗体交叉反应至少成倍稀释一抗/一抗（可410倍）*注15SDS非特异性结合 蛋白条带使用无SDS转膜液散在小圆斑封闭液有杂质颗静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注16*注 1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带。形成机制为条带处 HRP

18、很快将底物 耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为 黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因 3 的现象。 在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期 未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间?RP稍减 后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色， 原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上 面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因 3 的现

19、象。其分析和解决同上。*注2其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄，压出的片子可以是正常的或和 原因 1 或原因 3 的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时 间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物12min就可以看出来，所以要把握时机）。 如果没有达到原因 1 和原因 3 的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状 态，是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3的现象，可以不予处理。但因为 荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压 10s30s,甚至可以35s，即时

20、根据结果在暗室调整，荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子 而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如 果时间过短如3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的 本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有 限，故很少使用）来解决。原因 1和3若如是则解决也是一样的。*注 3 这是与1 类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因 4、 5、 6 混淆，特别需 要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。 可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧

21、光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也 可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达 10倍而依然荧光明显。超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量 /提高抗体浓度 /使用敏感底物 / 延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是 确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限 ,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分 子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不

22、变形作为极 限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带 早已融合或挤为棒槌形了）*注5对于非小分子量尤其是大分子量（100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充 分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压 /电流，延长时间。但对于小分子蛋白（ 30kd 就 要注意了，15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确 认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。 对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，抗体技术实验指南提供的针对中低分子量的 湿转缓与高分子量的相比也是不

23、含SDS的。*注6测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul,加入lul HRP偶联二抗， 若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。此外试剂公司还开发一些超 级底物，其敏感度可达到pg级，但价格昂贵，对某些表达较低的蛋白效果会好些，而且也超级 省抗体（其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上）。*注 7 高背景原因是因为 HRP 偶联二抗结合到膜上，其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接 结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结 合、洗脱不彻底等原因造成的。在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率，意

24、即以牺牲信号强度为代价。不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法?提高抗体浓度。这 种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感（如pg级底物，因极其敏感可把结合 到膜上的极其微量抗体产生的背景也显示出来，而这种背景在ng级底物即使压片过夜也没有显 示），无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条 带递减速度比背景还快，如果稀释抗体则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下 认为需要提高抗体含量以提高条带显示程度，而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害，如是则 可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的（我最近带一个研究生使用pg级超级

25、底 物时发现此现象并使用此方法解决背景高的难题，当时一抗稀释为原来的 4 倍，二抗稀释为原来 的10倍，即总稀释为原来的40倍仍然可以看到背景的荧光但条带的荧光却减了许多导致条带和 背景都无法区分了，后来回复原来浓度并稍微延长孵育时间则条带荧光明显盖过背景并减少压片 时间至5s解决）。*注8 一般室温24h,但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获 得较好的效果。局限。*注 12 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起 的有效。*注 13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时 尤其要小心。办

26、法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形 成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不 会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。*注 14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无（丽春红染），这点并 不多见。*注 15 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有。关于 western 的抗体选择最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据 个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个

27、因素，不包含 每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这 么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差。单抗虽然 特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度为会下降甚至为 0，故不稳定。 普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际做的抗 体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中都能做出 来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。*注 16 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。牛奶配好后在 4 度静置（最好放在尖底的管子内

28、），这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均 而特意混匀，只吸上面的，下面的颗粒则不要取。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。3、免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检 测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用 ,或者建议做一次梯度稀释,上样电 泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高, 可平衡一下盐的浓度,如,透析。4、形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度, 也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此,建议要根据不同温度下 适量增减激

29、活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为 15-20 分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10 分钟开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶 与外界氧气的结合。5、未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时,应确保 没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生 ,梳子拔出来时应该小心 ,不要破坏加样 孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。6、电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的旗袍和未聚合的丙烯酰胺,同时 建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通 （恒压 10

30、-20V,20-30min）。7、加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。8、样品缓冲液中煮沸的样品可在-20 C存放数，但是反复冻融会使蛋白质降解。9、为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。10、上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。11、取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记（如左上角）转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记（如左上角）以分清正反面和上下关系。*注 9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。 BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉， 但单就封闭能力而言却也因此而降低*注 10 一般 10min*3 次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。*注 11 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果