原核诱导表达汇总

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1、原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系 列实验。二适用范围：本 SOP 适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。三实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和 乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列 0、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因 编码一种阻遏蛋白，后者与 O 序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序 列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP ）结合位点。由P序列、0序列和CAP 结合位点共同构成 lac 操纵子的调控区，三个酶的编码基因即

2、由同一调控区调节，实 现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时， lac 操纵子处于阻遏状态。此时， I 序 列在 PI 启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时， lac 操纵子即可被诱导。在这个操纵子 体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b 半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白 与0序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ）是一种作用极强的诱导剂， 不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。四、试剂准备 :（一）实验器材的灭

3、菌：枪头的灭菌：ImL, 200卩L, 20卩L的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅 中灭菌，121 C, 20min。80C烘箱中烘干，常温放置。螺口管及离心管的灭菌： 将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开） ，放 入高压灭菌锅中灭菌，121 C，20min。80C烘箱中烘干，常温放置。50mL 离心管的灭菌：将 50mL 离心管用报纸包住（ 2 层），放入高压灭菌锅中灭菌， 121C， 20min。 80 C烘箱中烘干，常温放置。（二）LB 培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g 氯化钠 10g酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌

4、，4C保 存。固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 15g高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基 =1 ：1000（氨苄，卡那通常 浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放 于4C保存。（三）IM IPTG的配制：经过计算，10g IPTG可以配42ml的IM IPTG。买来的粉末状的IPTG 一般全部 配成 1M IPTG。1 、无菌操作台紫外线照射，后通风。2、用少量去离子水将 IPTG 溶解完全，并定容。3、在无菌操作台中，用0.22pm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管 中，过滤除菌，-

5、20 C保存。注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔 掉，排出气体，滤头加入 IPTG 液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。 滤的过程中，手不能碰滤头。（四）3xSDS-PAGE loading buffer 的配制：3xSDS-PAGE loading buffer10ml1M Tris-Hcl (PH 6.8)1.5mlSDS0.6gBPB（溴酚蓝）30mg甘油（丙三醇）3 ml去离子水5.5ml1. 将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解，可以在 37C水浴溶 解。完全溶解后，再加入 BPB，进行溶解。2. 把溶好的buffer

6、分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。3 使用前，每管加入 30pL 巯基乙醇。注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。（五）10xPBS的配制：0.1M PBS (10xPBS)1LNaH2PO4.2H2O2.83gNacl85gNa2HPO4.12H2O28.98g用去离子水将以上药品进行溶解。 （溶解的非常慢，可能需要过夜）调PH值到7.2，用0.4pm的滤膜过滤。常温保存。工作时用的是lxPBS。(六)1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制:1.5M Tris-Hcl250mlTris45.425gl 用 200ml 去离子水将 T

7、ris 溶解。2用浓盐酸调 PH 值到 8.8。3调好 PH 的 Tris-Hcl 定容到 250ml。4. 0.4pm的滤膜过滤，常温保存。注意事项: Tris 的缓冲能力很强，调 PH 值时，费些时间，但不要调过。(七) 1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制:1M Tris-Hcl250mlTris30.275g1 .用 200ml 去离子水将 Tris 溶解。2. 用浓盐酸调 PH 值到 6.83. 调好 PH 的 Tris-Hcl 定容到 250ml4. 0.4pm的滤膜过滤，常温保存。八） 30%丙烯酰胺的配制:30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5 mlBIS甲叉丙烯

8、酰胺2.5 ml1. 把药品用去离子水溶解后定容到 250ml。2. 用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4 C保存。注意事项:两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩九） 10%SDS 的配制:1 . 1g SDS 加入 10ml 去离子水进行溶解。2.分装到1.5ml离心管中，-20C保存。十） 10%过硫酸铵的配制:1. 1g 过硫酸铵加入 10ml 去离子水进行溶解。2. 分装到1.5ml离心管中，-20C保存。（十一） 5XSDS-PAGE电泳缓冲液的配制:5XSDS-PAGE电泳缓冲液1LTris15.1gGlycine （甘氨酸）94gSDS5g将以上药品用去离子水溶解后定容到 1L,常温

9、保存。工作时用的是lxSDS-PAGE 电泳缓冲液。（十二）考马斯亮蓝 R-250 染色液的配制:考马斯亮蓝R-250染色液1L1. 往lg考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。 2 加入 650ml 去离子水,磁力搅拌器搅拌过夜。3. 再加入100ml冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。4. 在通风橱内用滤纸进行过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。注意事项:在磁力搅拌器上搅拌时，要把容器封口。十三）脱色液的配制:脱色液1L醋酸（冰乙酸）100ml乙醇（无水乙醇）50ml去离子水850ml常温保存。四.实验步骤:（一）:质粒的转化1. 使用无菌操作台之前先用

10、75%的酒精擦拭，然后将灭菌的培养基以及所有要用到的 器具放到超净台上，在开紫外照射 30min 左右。操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手 用酒精擦拭后开始操作。2. 从-80C的冰箱中取出表达菌（BL21 ）的感受态细胞（每管100卩L）,在-80C 冰水中融化。3. 载体（PET32a等）与基因片段的连接后质粒1卩L,缓慢的加入到100卩L BL21 感受态中，冰置15min。（无菌操作）3. 42C下热激90s，随后在冰水中冰置5min。4. 涂板:先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。把 处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。用冷却的涂布棒进

11、行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。（无菌操作）5. 放在37 C培养箱中，倒置培养过夜。注意事项：1. 质粒的转化时，质粒是冻在-20的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感 受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。2. 质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。3. 质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布棒。防止感受态被烫死， 或固体培养基的损坏。（二）：挑菌与接菌：1. 无菌操作台紫外线照射，后通风。将转化后的平板取出。2. 在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验） 取出，在酒精

12、灯的外焰上灼烧螺口管管口。3. 灭菌后的LB培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。吸取LB 培养基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等）。氨苄霉素（卡那）: LB培养基=1:1000 （5.5卩L）,抗性由载体决定。4. 镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧， 将镊子晾凉。用晾凉的镊子， 夹取20卩L小枪头，在转化后的平板上挑取单菌落，扔到培养基中。5. 接好菌的螺口管，进行摇菌37C,180rpm。摇到菌的对数期（OD60o值0.4-0.6 ）， 时间大概2-3h。可以模糊看到手即可。（注意不要摇过）6. 用完的平板用封口膜封住，倒置放于 4C保

13、存。7若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB培养基=1： 100。注意事项：1. 接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不 要插进三角瓶中。2. 接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣 起来。3. 摇菌不要过了它的对数期，2小时后随时注意其生长状态。（三）小量保菌：1. 无菌操作台紫外线照射，后通风。2. 将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。3保菌：从灭菌的饭盒中取出4个1.5ml的灭菌的离心管，加入50卩L的灭菌后的 80%的甘油，并分别加入相应的350卩L菌液。一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌

14、。（若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做）4标清保菌的类别，名称，时间，如“BL21 PET32a VAV 1号2010.7.14”，其中的1号 是平行对照中它排几号。5. 混匀，-20C保存。注意事项：1. 在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。2. 在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌会被冻死。（四）蛋白诱导表达条件摸索1无菌操作台紫外线照射，后通风。2. 小量保菌后的四个平行实验组，分别加入不同终浓度的IPTG,在不同的温度条件下进行诱导（如下图）：对照编号IPTG终浓度诱导温度诱导温度1号1 mmol/L3h37 C2号0.1 mmol/L3h3

15、7 C3号1 mmol/L3h30 C4号0.1 mmol/L3h30 C（五）小量收菌1. 将诱导完成的四个平行实验组菌液，分别取出ImL,对应装于4个不同的1.5ml离 心管中并做好标记。剩余的平行实验组菌液放入4C保存。2. 离心7000rpm, 2min,使菌沉淀。3. 把上层培养基倒掉，用1ml 1xPBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm, 2min,使菌 沉淀。4. 把上层1xPBS倒掉，再次离心同步骤3。5. 用80卩L 1xPBS把表达菌体重悬。6. 在四个平行的重悬液中，分别加入80卩L 3xSDS-PAGE loading buffer。（把 3xSDS-PAGE lo

16、ading buffer 当成 2xSDS-PAGE loading buffer 用）7. 煮样 8min。 （打开锅盖煮）8. 离心 13000rpm,10min 。吸上清。9. 进行 SDS-PAGE 电泳。注意事项：在煮样时要打开锅盖煮，防止小样进水，若样进水，则不能再用。（六）SDS-PAGE 胶的配制1 .分离胶的配制（ 1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。随后用去离子水 试漏。（ 2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。依次将水、 3 0%丙烯酰胺、 1.5MTris-Hcl （PH 8.8 ）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图），混匀。（1

17、mm的胶板，一般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%，但浓度也要视情况 而定。蛋白越小，胶的浓度越大。 ）SDS-PAGE分离胶配方衣5 nnl110 nnlIS ml2D ml25 ml30 ml40 mlM ml跟CbIH?O2 .aE.910.6119 215.921 2QG.E生花Affylam盟iD2.03.04.D5.06.0ao10.01 .S M Tris-HO I pH6.fi)932.S3.Q5.DB37.51D.012.5WSDS030.10.15D.20 2SQ.3D40.60.050.1&.15D.20250.3D.40.5TEMED 骥QbCLM40.0D3&

18、.012G.D16D.020.024D.032a.o斗l-hO2.3斗厉&.99.311j513.91B.523.230 备赴 erf lam da132.74.05.36.73.01D.713.31.6 M TriHCI |pH8.S)2.6l.S5.D7.51D.012.5lOSDS0.050.1D.15D.20250.3D.40.510%辻正馥珏O.M0.1&.15Q2D2S0.3D.40.5TEMED1 筋 GSI0.M3O.ODSnagD.D12D.0150.01 SD.CG40.03hkOL94.05.97.99.911.915.S19.1933% Atrlan da1.73.35

19、.0G.710.01&S116.71Tn&-HQ |pH8132.G生呂S.Des7.510012.6105030.Q50.1&.15D.2D250.3D.40.510-4.过进裁珏0.050.10.15D.2D2S0.3DM0.5TEMED12% Gal0.0020 00*0.006&.D090 010.0120 0160.02HzOIE3.3牡9EkBB29.913.216.S30咯心bylmiTi de2.34.0B.OB.0WjQ12.01&020.C1.5 M niS-HQ IPMB.S)132.53.85.DE37.51D.012.5lOSDS0.050.1Q.15D.2D2S0.

20、3X0.52咯过诜發锤0.05D.1015D.2D2BQ.3D40.5TEMED 1S% Qel0.M20.004&.D3&D.maD.010.012D.01I50.02l-hO1.12.33.44l .6E.76.99.211.630% cr/iam de亦5075W.D12515020 02S.01.5 M Tris-HCl IpHB.e)132.53.fi5.D637.51D.012.510SDS0.0&0.10.15D.2D2B0.30.4C3占10过奁盘锁0.050.1D.15D.20250.3D.4a.sTEMED0.M2DJ004H.O0&D.ooaD.010.012D.01I6

21、0.02(3) 将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分(不要将滤纸塞到胶板底部)。(4) 小烧杯中再加入TEMED，混匀。(TEMED可使胶凝固，所以最后加)(5) 灌胶：混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡。(6) 用水将分离胶压平。(用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起)2. 浓缩胶的配制(1) 待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制，依 次将水、30%丙烯酰胺、l.OM Tris-Hcl (PH 6.8 )、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净 的小烧杯中(如下图)SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)丙已方表S科疑注检和崩刘应的各

22、科纽骨的取样A1 ml2 ml3 m il4 ml5 mlBmllB mil10 ml1100.6S1.42.1273.44d5.5s.e30% AcrylAmiidiifD.17C.330.5.670.631.01.31L7L0 MTrlSrHClD.130.250-39D.50.630.751.D11.2510%SC$D.010.02.040.05D.M0.D5d10%过帝够第D.01C-Q20_D3.040.050.D5.1TEMED00010002O.DD30 004 005CQ0I50 MBa oi(2) 将分离胶上层的水倒掉，并用滤纸吸干水分。(尽量不要把滤纸插入)(3) 小烧杯中

23、再加入TEMED，混匀。(4) 灌胶。然后插入梳子。(5) 把制胶器倒过来，胶仍然不会往外流，或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去，说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内，并在电泳槽内加入 SDS-PAGE电泳缓冲液，把胶浸泡一段时间，时间越长越好。(防止梳子与胶相连,或胶因湿度不够而萎缩）（6）点样时，再把梳子拔出来，拔时动作要轻，防止胶齿被拔断。（七）未诱导和空载的制备 在诱导表达中，有两个重要的对照组，即空载诱导和未诱导。1未诱导的制备（1）未诱导是我们所做一个基因除了四个平行实验外，再做的一个对照组菌，唯一不 同的是它不进行诱导（接菌步骤如上），在37C下，进行摇菌，不加I

24、PTG,摇起来即可。（和 表达完的菌浓度差不多即可）（2）未诱导的菌进行小量处理，见上面的小量收菌。2空载诱导的制备（ 1 ）空载的转化： 将不连基因片段的空载体质粒，转入表达菌（和前面的试验用一个表达菌） ，如 “BL21-PET32a-VAV质粒”转入“BL21表达菌”，其空载应当是“BL21-PET32a”转入“BL21表 达菌”。转化步骤同上。（2）空载接一个菌（实验组），并摇菌摇到对数期（步骤同上）。（3）空载的诱导：空载的诱导条件固定为温度37C，时间3h. , IPTG终浓度为lmmol/L。（诱导步骤 如上）。（4）空载的菌进行小量处理，见上面的小量收菌。（八）蛋白诱导表达条件

25、摸索的 SDS-PAGE 电泳1. 拔掉SDS胶上的梳子，并用小针调整齿的位置（使它们都平行）。2. 点样。用20卩L的小枪头，吸煮过的样品10卩L，对准胶孔点样，注意不要把样品点在外面。我们用的 marker 是低分子量蛋白 marker 。 一般的点样顺序是：1234567空载未诱导样品1号样品2号样品3号样品4号marker3开始电泳，电泳仪正负极接好，打开电源。浓缩胶：电压 low 100V 分离胶：电压 high 150V。4卸胶染色。等胶内的所有的蓝色都跑出去，电泳停止，一般时间为1 小时 45 分。把胶板从电泳仪上卸下，用刀片把胶板撬开，胶的浓缩胶部分割除，放入考马斯亮蓝R-25

26、0 染色液中进行常温过夜染色。5. 脱色。将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色，直到背景发白。（九）四个平行实验组菌液的选择 1将脱好的胶拿出进行观察，看四个平行实验组菌液是否进行了蛋白表达。一般来说， 未诱导没有过量的蛋白表达，而空载有一处蛋白的过量表达（大小由表达载体决定），四个 平行实验组也有一处蛋白的过量表达，它比空载表达的蛋白要大，大出的那一部分即我们的 目的蛋白。2若平行实验组中无过量蛋白表达，尤其是37C，lmmol/L，3h无过量蛋白表达， 则说明蛋白无表达。3若平行实验组中有过量蛋白表达，但它的大小与空载的大小相同。这说明蛋白进行 了漏表达。4.若蛋白表达正常，

27、则选择诱导温度最低,IPTG浓度最低的实验组（30C, 0.1 mmol/L, 3h）,进行下面的小量超声实验。（十）表达菌的小量超声实验1. 把以上做的四个平行实验组菌液从4C中拿出。2. 将最有条件的实验菌全部收集在1.5ml的小离心管中。（其他平行实验组的菌进行 灭菌）3. 离心7000rpm, 2min,使菌沉淀。4. 把上层培养基倒掉，用1ml 1xPBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm, 2min,使菌 沉淀。5. 把上层1xPBS倒掉，再次离心同步骤3。6. 用500卩L 1xPBS把表达菌重悬。7. 将菌液放入小玻璃管中，准备进行超声。8将超声仪打开预热20min,并准备冰

28、盒。9将呈菌液的小玻璃管放入冰盒进行超声，超声效率为3050HZ,超声3s,停5s。 直到菌液超澄清（透明呈现鸡蛋清色）。10. 将超开的菌液进行离心，13000rpm, 10min。11. 离心产物上清取出100卩L，加入100卩L3xSDS-PAGE loading buffer。12. 上清倒掉，沉淀用 1ml 1xPBS 把表达菌重悬，再次离心 13000rpm，10min。13. 重复 11 步。14. 上清倒掉，用100卩L将沉淀悬起，加入 100卩L3xSDS-PAGE loading buffer o15. 上清和沉淀都进行煮样，开锅盖，8min。16. 离心 13000rpm

29、,10min 。吸上清。17. 进行SDS电泳。注意事项：1. 小样超声时，要超彻底，一般超 45 分钟即澄清。若仍然不澄清，则可能是包涵 体。超的过程中不要超糊。2. 在洗超声离心物的沉淀时，要洗干净。（十一）破菌超声的 SDS-PAGE 电泳1.配胶、点样、电泳的步骤如上。破菌超声的点样顺序一般为123456marker未诱导空载全菌破菌上清破菌沉淀未诱导，空载，全菌为摸索表达条件时所用的样品。 注：我们破的几号菌，就上几号的全菌样。2.若破菌上清表达的蛋白与全菌的蛋白分子量一致（目的蛋白） 且破菌沉淀中没有这说明蛋白可溶；若破菌沉淀中有目的蛋白，而破菌上清中没有，说明蛋白为包涵体。（十二

30、）目的蛋白的大量表达（1L）1. 配制培养基1L,每大瓶500ml,高压灭菌4C保存。2. 一级接菌：摸索完条件的表达菌进行接菌3管，每管5ml。抗性：培养基=1:1000, 菌液：培养基=1:100。（菌液为针对可溶条件的小量保菌液）步骤如上。37C, 120rpm,过 夜摇菌。3标准保菌：lOOyL灭菌甘油加入700卩L过夜菌。混匀，-20C保存。（写好名称 日期，如上，放入表达菌的库中）3. 二级接菌：对大瓶进行接菌，抗性：培养基1:1000,菌液：培养基=1:100。即每瓶 5ml。4. 摇菌：37C, 180rpm，摇到对数期，摇到菌的对数期（0。600值0.4-0.6 ）,时间 大

31、概2-3h。可以模糊的看到手即可。（注意在摇过程中随时观察状态，不要摇过）5诱导：依据摸索好的条件进行诱导。（十三）大量诱导的收菌：150ml 离心管灭菌烘干，待用。 2找出两个 50ml 离心管，管盖和管壁上做标记，并称重。3. 6个50ml离心管（包括称重的两个），倒入菌液（4045ml）。配平，离心7000rpm, 10min。4. 倒掉上清，用1xPBS把菌重悬，离心7000rpm， 10min。5. 重复 4。6. 倒掉上清，称菌体的重量。7. 悬菌。1g菌体加入35ml的纯化时用的上样缓冲液悬起。-20C保存。（十四）大量表达菌的超声1. 把表达菌从-20C拿出，在流水中融化。2.

32、 把完全融化的表达菌，放入小烧杯中准备超声。3将超声仪打开预热20min，并准备冰盒。4将呈菌液的小烧杯放入冰盒进行超声，超声效率为3050HZ，超声3s，停5s。直到菌液超澄清，呈现鸡蛋清色。（一般超20-30min，注意不要吵时间太长，使 菌超糊）5. 将超开的菌液进行离心， 13000rpm， 10min。6. 将上清收集在灭菌的 50ml 离心管中，进行纯化。五.促进原核表达的蛋白可溶的方法： 一般来说，人们认为包涵体的形成是因为新生多肽链不能在正确位置形成二硫 键，二硫键错配， 进而错误折叠的结果。而 IPTG 浓度越低，温度越低，一般蛋白的 可溶性越大，因为这样的条件下，可以减慢蛋

33、白的形成，减少蛋白的二硫键错配，从 而促进蛋白的可溶。1.使蛋白可溶的条件并不是固定的，一般来说，以上条件就可是蛋白可溶（有时 2/4 条件可以把 IPTG 浓度提的高一点）。 但如果仍不可溶的话， 可以试一下 0.025mmol/L ，常温，过夜诱导。这种条件是 IPTG 使用量的最小浓度，可以使包涵体 部分可溶。2. 180rpm 摇菌摇对数时，不要摇过。对数期时，是表达菌产蛋白的最佳时期。 表达菌浓度太大，对菌中蛋白的可溶性影响会很大。所以在摇菌到 2h 后，一定密切 关注菌的浓度， 随时用分光光度计测 OD600 值。这就意味着在接菌时， 多接一些菌（由 实际情况而定）。3. 蛋白的可

34、溶与表达菌也有关系。 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的 BL21 系列 就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的 BL21(DE3) 融源菌则是添 加 T7 聚合酶基因，为 T7 表达系统而设计。 BL21(DE3) 即我们做表达是常用的表达菌。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的 时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达 效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法， Rosetta 2 系列就是更好的

35、选 择 这 种 携 带 pRARE2 质 粒 的 BL21 衍 生 菌 ， 补 充 大 肠 杆 菌 缺 乏 的 七 种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基 因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。(已经携带有氯霉素抗性质粒) 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择 K-12 衍生菌Origami 2 系列， thioredoxin reductase (trxB) 和 glutathione reductase (gor) 两条主要还原 途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。

36、(卡那霉素敏感)Rosetta- gami 2 则是综合上述两类菌株的优点，既补充 7 种稀有密码子，又能够 促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。(卡那 霉素敏感)Origami B 是衍生自 lacZY 突变的 BL21 菌株，这个突变能根据 IPTG 的浓度精 确调节表达产物，使得表达产物量呈现 IPTG 浓度依赖性。(四环素敏感)在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小 Tips 是要注意的，一个是不同菌株 有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性， 要注意自己的表达质粒是否能 与之兼容。比如 Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯

37、霉素筛选等等。现象可能原因改进方案建议菌株无蛋白表达E. coli的密码子偏移性补充稀有密码子的 tRNA ；将稀有密码子突变为 普通大肠杆菌密码子Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami BRosettaBlue出现截短蛋白包涵体二硫键形成困难降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的 各种载体标签Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B表达过快，表达量过咼控制优化表达水 平：降温，IPTG浓度优化TunerRosetta-gami B蛋白无活性蛋白错误折叠降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的 各种载体标签Origami

38、2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化更严格的本底表达 控制TunerRosetta-gami BpLysS菌株细胞死亡，生长 极困难毒性蛋白无克隆生长过高本底表达更严格的本底表达 控制pLysS、 pLysE菌株4若实在不可溶，只能把蛋白截短，这样可溶性会明显增加。六 SDS-PAGE 的相关技巧： 1SDS-PAGE 电泳的原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS (十二烷基硫酸钠)， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总 是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此

39、 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电 泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污 剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线 性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳， 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子 量。2SDS-PAGE 电泳遇到的相关问题及解答。(1) 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tri

40、sHCL 缓冲系统，浓 缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9 ；而电泳缓冲液使用的Tris 甘氨酸缓冲系统。在浓缩 胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低； 而 CL 离子却很高， 两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子 聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈 碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径 的缩小，在电场的作用下， 蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以， pH

41、 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解 决问题的情况，应首要考虑该因素。(2) 提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不 充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天， SDS 可水解聚丙烯酰 胺。(4)“微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办 法：待其充分凝固再作后续实验。( 5)“皱眉” (两边向下中间鼓起)形带原因？主要出

42、现在蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。( 6)为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心； 选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低 凝胶浓度。（7）为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。（8）什么是 “鬼带 ”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时 在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的 过程中被氧化

43、而失去活性， 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔 合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标 条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理 办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂； 或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。（9）为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主 要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer ；降低分离胶 的浓度。（10）为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩 胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（ 6.7）；适当降低电压。