分子克隆

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1、分子克隆（一一）基本）基本概念概念:克隆（克隆（Clone)指的是通过无性繁殖过程所产生的与指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。亲代完全相同的子代群体。分子克隆（分子克隆（Molecular Cloning)是是在体外对在体外对DNA分分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。得新得遗传特征的过程。载体载体DNA（vector）目的目

2、的DNA（target fragment）重组重组DNA（recombinant DNA）宿主宿主（hosthost）筛选、扩增筛选、扩增克隆（克隆（cloneclone）分子克隆的路线分子克隆的路线DNA DNA 重组重组转化转化分子克隆的基本过程分子克隆的基本过程分分获取目的基因和取目的基因和载体体接接目的基因与目的基因与载体的体的连接接筛筛重重组DNA的的筛选与与鉴定定转转重重组DNA导入宿主入宿主细胞胞目的基因的获取目的基因的获取-PCR-PCR技术技术:定义：定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体

3、内，是通过模拟体内 DNA 复制的复制的 方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩某个特殊区域扩 增出来的技术。增出来的技术。Heat-stable polymerase is vital to the ease of the processthermusthermus aquaticusaquaticusTaq DNA多聚酶的发现多聚酶的发现19881988年年Saiki Saiki 等从温泉等从温泉（HotspringHotspring）中分离）中分离的一株水生嗜热杆菌的一株水生嗜热杆菌(thermusthermus aquaticusaquaticus)中提取

4、到一种耐热中提取到一种耐热DNADNA聚合酶。聚合酶。此酶具有以下特点此酶具有以下特点：耐高温，耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度长度(2.0Kb)(2.0Kb)。酶命名为酶命名为TaqTaq DNA DNA多聚酶多聚酶(TaqTaq DNA DNA Polymerase)Polymerase)。此酶的发现使被。此酶的发现使被PCRPCR广泛应用。广泛应用。在在 19891989年，年，ScienceScience将将PC

5、RPCR中的中的TaqTaq DNA DNA多聚酶命多聚酶命 名为当年的风云分子名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)(Moleculeoftheyear)94949494变性变性变性变性 50-6550-65退火退火退火退火72延伸延伸延伸延伸2.PCR2.PCR反应过程：反应过程：20-4020-40个个个个PCRPCR循环循环循环循环1 1个个PCRPCR循环循环PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火n 模板：单链或双链模板：单链或双链DNAD

6、NAn 引物：引物：16-30 16-30 bpbp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸n DNADNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNADNA聚合酶聚合酶n 底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷n （dNTPdNTP:dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP、dGTPdGTP)n Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+：DNADNADNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂n 3.PCR3.PCR基本要素基本要素4.PCR4.PCR反应程序反应程序9496 30-3 9496 30-3 预变性（使模板预变性（使模板DNADNA充分变性）充分变性）94 30

7、 94 30 变性变性50-60 30-1 50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72 n(72 n(按按11扩增扩增1kb1kb计算）延伸计算）延伸 72 3-7 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）总的延伸（使产物延伸完整）4-10 4-10 保存保存 25-25-3535个循个循环环 3.3.与反转录相关的与反转录相关的PCRPCR扩增扩增 RT-PCR RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):reverse transcriptase-PCR,RT-PCR):又称反转录又称反转录PCR,PCR,是以反

8、转录的是以反转录的cDNAcDNA作模板所进行的作模板所进行的PCRPCR，可对基因的表达和序列多态性分析。可对基因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶逆转录酶反转录反转录 T T T T TnTTnTcDNA第一链第一链mRNAPCRPCR结果图结果图 重组重组DNADNA导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型转化：以以质粒粒作作载体构建的重体构建的重组体体导入受体入受体细胞的胞的过程程转染：以以病毒病毒作作载体构建的重体构建的重组体体导入受体入受体细胞的胞的过程程转导：以以噬菌体噬菌体作作载体构建的重体构建的重组体体导入受体入受体细胞的胞的过程程

9、类类类类型型型型重组重组DNADNA的筛选与鉴定的筛选与鉴定PCRPCR筛选重组体筛选重组体原位杂交技术原位杂交技术4 41 12 23 3重组DNA的筛选与鉴定方法平板筛选（插入失活、蓝白筛选）平板筛选（插入失活、蓝白筛选）2.2.分子克隆中常用工具酶：分子克隆中常用工具酶：（1）.使核酸降解的核酸酶类：使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶。核酸内切酶、核酸外切酶。（2）.催化核酸合成的酶类：催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。聚合酶，连接酶，逆转录酶。是由细菌自己产生的一种能识别双是由细菌自己产生的一种能识别双链链DNADNA中的特定序列，并以

10、内切方式水中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNADNA物质，例如病毒等；而细菌本身的物质，例如病毒等；而细菌本身的DNADNA同一识别序列中的某些碱基被甲基同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。化所保护。.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction(restriction endonucleaseendonuclease，RE)RE)的定义的定义限制性内切酶限制性内切酶(Restriction Endonuclease)(Restriction

11、 Endonuclease)TaqDNATaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction(polymerase chain reaction，PCR)PCR)中，中，能以能以DNADNA为模板，从结合在模板上的引物为模板，从结合在模板上的引物出发，以出发，以dNTPdNTP为原料，按碱基配对方式，为原料，按碱基配对方式，从从5 5-3-3方向合成新的方向合成新的DNADNA链。链。TaqDNATaqDNA聚合酶在聚合酶在70707575时具有最佳的生物活时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。性，随着温度的降

12、低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏同时此酶缺乏3 3-5-5外切酶活性，因而无外切酶活性，因而无校正功能。校正功能。催化双链催化双链DNADNA中相邻碱基的中相邻碱基的5 5磷酸磷酸和和3 3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为为DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)。DNADNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种：T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 .DNA.DNA连接酶：连接酶：3.3.基因克隆常用载体基因克隆常用载体目前用于基因克隆的载体种类繁多，目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在

13、大肠杆菌中使用的包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体物病毒载体等等 （二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程.质粒质粒载体：载体：质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)(replicon)，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。包括各种抗药基因或营养代谢基因等。氨苄青霉素抗性氨苄青霉素

14、抗性(ampicillin(ampicillin resistanceresistance，ampampr r)基因基因：此基因编码此基因编码内酰胺酶，该酶能内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素水解氨苄青霉素内酰胺环，使之内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。失效而使细菌产生耐药。遗传选择标记：遗传选择标记：DNA限制性内切酶DNA连接酶 100l4.4.目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备、人工合成基因、人工合成基因、应用聚合酶链反应获取目的基因、应用聚合酶链反应获取目的基因（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程5.5.目的基因的体外重组目的基因的体外重组 DNA DNA分子的体外重组

15、分子的体外重组:是是DNADNA分分子之间的连接过程。这是一个子之间的连接过程。这是一个DNADNA连接酶催化的生物化学反应连接酶催化的生物化学反应 。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程6.6.重组子导入宿主细胞重组子导入宿主细胞 体外重组生成的重组子必须导入到体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。扩增和表达。宿主细胞分为两种：原核细胞和真宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。核细胞。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程感受态细胞感受态细胞(competent cell):(competent cell)

16、:系指利用理化的方法人工诱导系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外细菌，使之处于易于吸收和容纳外源源DNADNA分子的状态，这时的细胞就分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。称为感受态细胞。转化过程：转化过程：.用冰预冷的用冰预冷的CaClCaCl2 2处理细胞：即处理细胞：即用低渗用低渗CaClCaCl2 2溶液在溶液在00时处理快速时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。生长的细胞，从而获得感受态细胞。.此时细胞膨胀成球型，外源此时细胞膨胀成球型，外源DNADNA分子在此条件下易形成抗分子在此条件下易形成抗DNADNA酶的酶的羟基羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。钙磷

17、酸复合物粘附于细胞表面。（二）（二）DNADNA进入细胞：进入细胞：.通过热激作用促进细胞对通过热激作用促进细胞对DNADNA的吸收。的吸收。.然后将细胞接种于含相应抗生然后将细胞接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。态细菌将形成单菌落。.挑选单菌落进行相应的筛选及挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。鉴定分析。7.7.阳性重组子的筛选和鉴定阳性重组子的筛选和鉴定（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Amp

18、(Ampr r)、抗四环素基因抗四环素基因(Tet(Tetr r)、抗卡那霉素基因、抗卡那霉素基因(Kan(Kanr r)等。如果外源等。如果外源DNADNA片段插入载体片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。抗生素平板筛选抗生素平板筛选pEGFP-N2载载体片段体片段PPAR基因基因片段片段PGL4-luc载载体片段体片段PPRE4基因片段基因片段pEGFP-N2-PPARpGL4-PPRE4-luc接种菌液菌液