《植物五种酶活性检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物五种酶活性检测方法（2页珍藏版）》请在装配图网上搜索。
1、选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点（0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h）取样，每个样品重复三次，测定 PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4C、9000r/min离心 35min，取上清液，过滤得到初酶液。取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL，混合反应液（L柠檬 酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:
2、2:3），反应30min（37C恒温水浴锅）， 6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分 钟增加为一个活性单位。2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L （）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适 量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在 4C冰箱中浸提4h。4C 10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀， 在40C水浴上反应
3、30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲 液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度 变化为一个活力单位。3、脂氧合酶（linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX）活性的测定取新鲜样品，加7ml经4C预冷的1mol/L （）的tris-HCL缓冲液冰浴上研 磨。4C、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。以亚油酸作为底物，加入酶液在234nm处测定吸光值，每隔30s读数一次， 共测5分钟。Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化作为一个活力单 位。4、过氧化物酶（PDA）的活性测定
4、（愈创木酚法）取克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质L的磷酸缓冲液（含 1%PVP聚乙烯毗咯烷酮）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入 离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min，得到酶初提液。取200mlPBS磷酸缓冲液（,）,加入液体（原液）愈创木酚2-甲氧基酚） 加热搅拌溶解，冷却后加入30%的H202,混匀后保存于冰箱中备用。取3ml反应 液并加入30ul酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定30s读数一 次，5分钟）。（边加样边测定，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始计 时的时间相差不大）酶活性计算：以每分钟OD值得变化
5、（升高）为一个酶活性单位（u）。POD= （AA470XVt） / （WXVsXXt） （u/g?min）?AA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）； t为反应时间（min）； Vt为提取酶液总体积（ml，）； Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。5、过氧化氢酶（Catalase CAT）活性测定取克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质L的磷酸缓冲液（含 1%PVP）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰 箱中冷提12h。1000r/min离心20min，得到酶初提液。取200ml PBS （，），加入30%的H2O2 （原液）摇匀即可。取3ml反应液加入（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240 （紫 外）。（测定30s读数一次，5分钟）。酶活性计算：以每min OD值减少为1个酶活性单位（u）。CAT=AA240XVt / （WXVsXXt）（u/g min）AA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）； t为反应时间（min）； Vt为提取酶液总体积（ml， ）； Vs为测定时取用酶液体积（ml,）。
植物五种酶活性检测方法
