利妥昔单抗原液生产车间工艺设计

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1、摘要利妥昔单抗是目前世界上治疗淋巴瘤最重要的药物之一，且近年来研究发现 其在治疗肾脏疾病中也有重要应用。当前我国生产利妥昔单抗的企业有限，而需 求量又比较多，因此设计一间生产利妥昔单抗原液的生产车间具有非常大的市场 前景。本设计的工艺流程主要分为细胞大规模培养、层析纯化这两个阶段，其中选 用了流加式分批补料的方式在 2000L 发酵罐中进行大规模生产利妥昔单抗，并 在下游工艺中采用亲和层析和两步离子交换层析对利妥昔单抗进行纯化精制，目 的是达到产率高、纯度高的利妥昔单抗原液。根据发酵罐使用时间设计每年生产 15 个批次。本设计内容主要包括利妥昔单抗的相关介绍，工艺流程的选择和设计，每个 周期及

2、全年的关键物料衡算和主要的热量衡算、水平衡计算和耗冷量计算，以及 生产工艺流程图、设备的选型及设备一览表、车间平面布置图。关键词：利妥昔单抗；发酵；层析；生产车间；设计AbstractRituximab is one of the most important medicine in the treatment of lymphoma around the world, and in recent years, it has also been found to have important applications in the treatment of kidney diseases. C

3、urrently, Chinas rituximab production enterprises are limited, and the demand is relatively large, so the design of a production workshop of rituximab liquid has a very big market prospect.The design process is mainly divided into cells of mass culture, these two stages of chromatography purificatio

4、n, which chooses the flow and type of batch feeding way for mass production in the 2000L fermentation tank rituxan, and used in the downstream process affinity chromatography and two-step ion exchange chromatography for purification of rituxan refined, purpose is to achieve high yield, high purity o

5、f rituxan concentrate. It is designed to produce 15 batches per year according to the use time of fermentation tank.This design mainly includes the related introduction of rituximab, the selection and design of process flow, the key material balance and the main heat balance, water balance and cooli

6、ng calculation for each cycle and the whole year, as well as the production process flow chart, equipment selection and equipment list, workshop layout.Key words ： Rituximab ； fermentation ； chromatography ； The production workshop；design目录第一章 绪论 11.1 前言 11.1.1 利妥昔单抗的简介 11.1.2 利妥昔单抗的现状 11.2 生产工艺的设计方

7、案21.2.1 生产工艺的选择 21.2.2 设计方案路线31.3 设计的意义及可行性分析4第二章 工艺流程设计42.1 生产利妥昔单抗的质量标准 42.2 生产工艺流程52.2.1 细胞培养52.2.2 产品纯化 6第三章 工艺计算 83.1 物料平衡计算83.2 热量平衡计算123.3 水平衡计算 123.4 耗冷量计算 12第四章 设备选型 134.1 设备选型的原则134.2 设备选型13第五章 车间布置设计 175.1 设计原则175.2 车间布置设计 185.3 车间布置图 18参考文献18致谢错误!未定义书签。附录20第一章 绪论1.1 前言1.1.1 利妥昔单抗的简介利妥昔单抗

8、(rituximab),又名美罗华，是由人源IgGl恒定区和鼠源抗CD20 抗体的可变区组成的抗CD20重组人鼠嵌合型单克隆抗体，能够与B淋巴细胞 表面的跨膜抗原CD20识别并特异性结合，启动介导B细胞溶解的免疫反应，高 效且定向产生细胞毒作用、抗增殖效应，诱导 B 细胞凋亡，从而使得 B 细胞溶 解清除。利妥昔单抗是世界上首个被批准用于淋巴瘤治疗的单克隆抗体，在非霍奇金 淋巴瘤如弥漫大B细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤的治疗中取得显著疗效2。而对 于惰性非霍奇金淋巴瘤，利妥昔单抗同样也取得了良好的疗效3。临床研究数据 显示，经过使用利妥昔单抗维持治疗后，能够显著改善患者的无进展生存时间。 另外，在

9、肾脏疾病中，利妥昔单抗在治疗特发性膜性肾病(IMN)、IgA肾病、 微小病变肾病、狼疮肾炎等肾脏疾病中已经得到应用4。1.1.2 利妥昔单抗的现状众所周知，单克隆抗体药物的优势有靶向性强，特异性高，副作用小，安全 和高效等等。单抗不仅可以增强药效，同时能够减轻患者的痛苦，同时更快治愈 病人的疾病。然而单抗药物的使用的主要特点是用量多，费用高，一般患者长期 治疗下来可能需要的费用是巨大的。据官方数据显示，我国淋巴瘤类型患者中， 接近60%是B细胞淋巴瘤患者，在这其中最为常见的是弥漫大B细胞淋巴瘤。 然而，此类淋巴瘤疾病难发现，难治疗，一直是世界上医疗届的难题，而利妥昔 单抗的问世为淋巴瘤的治疗带

10、来了希望的曙光。临床数据显示，使用利妥昔单抗 进行时长 68 周期的治疗， 70%的患者可能治愈，利妥昔单抗为淋巴瘤患者延长 了生存时间。利妥昔单抗在2000年4月进入中国市场，当时的价格为100mg/10mL 需要3416元，500mg/50mL则需16041元。在2017年，利妥昔单抗列入医保， 100mg/10mL价格降为2418元，500mg/50mL价格降为8298元。虽然如此，但 是在经过 68 个周期治疗使用下来，对大部分患者家庭来说仍无疑是巨大的负 担，这是因为在中国，淋巴瘤患者大多数都是中低收入人群，其中更有高达 88% 的淋巴瘤患者的家庭年收入在20万元以下，而治疗所需要的

11、高昂的费用无疑对 这些低收入家庭来说是一个天文数字。所幸，在2019年2月，国家药监局对外宣布首个国产生物类似药利妥 昔单抗获批上市，这是国内生物类似药生产的重大突破 5，另外，其规格为 100mg/10mL的售价约为1640元。同年8月，复宏汉霖决定将其所生产的利妥 昔单抗（100mg/10ml）中标价格下降为1398元/瓶，降幅约14.8%6。此次降价， 对于每一位患者而言，一个疗程注射都将节省超过 5000 元治疗费用，按照 DLBCL 患者至少 6-8 个疗程的治疗，每位患者将至少可以省下 3 万到 4 万元的 治疗费用7。至于其安全性，临床数据显示，注射了利妥昔单抗后产生不良反应 的

12、病例很少，仅为4.25%，而且这其中大部分都是属于中轻度的不良反应。哈尔 滨血液肿瘤研究所所长、中国临床肿瘤学会副理事长马军教授表示，那 1552例 患者用药数据表明了其与原研利妥昔单抗在安全性方面没有差别，这进一步证实 了国产利妥昔单抗的安全性8。由此可见，国产利妥昔单抗的上市，不仅是国内 生产生物类似药的一个突破，更是为患者带来了更多生存的希望。另外，虽然利妥昔单抗是安全且高效的，但是临床数据显示，有部分患者在 注射利妥昔单抗后出现了不良反应，主要表现为过敏样反应。但发生的不良事件 通常发生在合并用药的患者中，与利妥昔单抗的因果关系并不十分明确。不过， 总体来说，利妥昔单抗的使用是安全且高

13、效的，也能减少目前多数免疫抑制剂的 使用量10。1.2生产工艺的设计方案1.2.1 生产工艺的选择近年来，生物制剂企业生产时选用的上游工艺（从种子到收获）常用有两种 细胞培养模型：流加式细胞培养以及连续灌流式细胞培养。流加式细胞培养的原理是根据培养的细胞对营养物质的需求，连续向发酵罐 中流加浓缩营养物，而且在整个发酵过程中，没有培养基流出。采用流加式细胞 培养的优势在于：可重复性强、操作相对比较简单，易于放大和高产率。相较于 连续灌注模式，由于整个培养过程没有培养基的流出，减少了污染，不过发酵罐 的尺寸限制了采用流加式细胞培养生产的产能。灌流式培养是把培养基和细胞一起加入发酵罐中进行培养，在整

14、个细胞培养 过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又不断向发酵罐灌注新鲜培养基11。 灌流式培养的优点为其操作浓度较高，与补料分批培养相比，灌流式培养能达到 10到30倍的浓度，与此同时，灌流式培养对生产空间的要求不高，但是需要消 耗大量的培养基，增加人工操作成本。对比之下，因为本设计选用的是以 2000L 发酵罐进行大规模培养，且考虑 经济成本上，上游工艺选择用流加式培养，这样一来可以减少人力物力的生产成 本，提高经济效益。而下游工艺（从蛋白捕获到原液收获）一般是将上游收集到的单抗经过精纯 及病毒的灭活得到最后的原液。经离心过滤后，一般选用亲和层析或者离子交换 层析进行分离纯化。亲和层析法

15、是利用抗原抗体的特异性结合进行分离纯化。此法分离出的抗体 纯度很高可达 90%以上，可以为后续的分离节省步骤，但是缺点是费用高，载量 低，线性流速有限，需低pH洗脱，protein A脱落等。离子交换层析法的原理是利用目标物质带的电荷与介质带的电荷相反，根据 正反电荷相互吸引，利用静电力的作用结合，然后再用高离子或改变pH的方式 洗脱。此法可以大大降低纯化成本，缩短纯化时间。但是与亲和层析相比，其特 异性较差。若是将这两种分离纯化方法单独使用，则其各自的缺点不可避免。若将两者 结合使用，即先用亲和层析法捕获大量抗体，再经过离子交换层析进行精纯，则 能够互相弥补各自的不足之处，将效率最大化。同时

16、，将两者结合在一起使用已 经在工业上得到了广泛的应用，得到了实践的验证。不仅如此，将亲和层析法和 离子交换层析法结合在一起，即通过亲和层析将大部分利妥昔单抗捕获，虽然理 论上得到的抗体纯度是 100%，然而实际上还是会存在一些杂质，如杂蛋白质， 细胞DNA碎片，接着根据蛋白质等电点的不同利用离子亲和层析法将其分离精 纯，能够将经济效益最大化，得到高纯度的利妥昔单抗原液。另外，离子交换层析柱的离子交换介质价格低廉，而且可以重复使用百次以 上，并耐强碱，不仅如此，阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L，可以节省 介质的投入量，从而降低成本。因此，使用离子交换层析的经济效益是非常高的， 符合本设计

17、的经济理念。因此，在下游工艺中选择亲和层析法进行利妥昔单抗的 捕获，阳离子交换层析和阴离子交换层析进行抗体的精纯。综上，上游工艺选用流加式细胞培养，下游工艺选用亲和层析法进行利妥昔 单抗的捕获，阳离子交换层析和阴离子交换层析进行抗体的精纯。1.2.2 设计方案路线拯曲培菲联I捕谦加成细削命掉齊和层析连-纹盘询心.珮於过號UF/DFfcpHffhM為于住换泾析20001图 1 生产路线图将冻存的能单一性分泌利妥昔单抗的工程细胞株进行复苏，将种子液进行摇 瓶培养，待培养到一定细胞密度时，接种到 2000L 的发酵罐中进行大规模流加 式细胞发酵培养，收集发酵液进行连续流离心、深层过滤后，取上清，进行

18、亲和 层析捕获大部分的利妥昔单抗。经低 pH 孵育，将病毒，尤其是包膜病毒灭活后， 经过阳离子交换层析和阴离子交换层析对利妥昔单抗进行精纯，最后经过病毒的 过滤和UF/DF （超滤/渗滤）完成纯化，得到高纯度的利妥昔单抗原液。 1.3设计的意义及可行性分析随着利妥昔单抗的问世，其在治疗淋巴瘤的药物中占据着非常重要的地位， 与此同时，近年利妥昔单抗在治疗一些肾脏疾病也得到了应用，给患者带来了希 望。利妥昔单抗作为抗体类药物，主要特点是临床用药剂量大，同时费用高。但 是，国内生物制品企业能够生产利妥昔单抗的数量仍是不够的，若从国外引进， 则会带来巨大的成本，因此在国内对于利妥昔单抗的需求与国内生产

19、利妥昔单抗 企业不足这一对主要矛盾下，设计一间生产效率高、厂房利用率高、绿色环保的 利妥昔单抗原液的生产车间显得很有必要，若能投入使用，将节省成本，提高经 济效益，同时也能够减轻患者的负担。另外也有临床数据显示，虽然利妥昔单抗的安全性高，但是仍有少数患者出 现不良反应，如在治疗IMN上，利妥昔单抗并未列入IMN的一线治疗方案。因 此，若能有成本相对较低，数量较多的利妥昔单抗能够用于临床研究，找出使用 利妥昔单抗后出现不良反应的原因，也能够为肾脏疾病的治疗提供帮助。本设计采用的是 2000L 的发酵罐进行发酵培养，属于大规模培养。本设计 的优势在于生产规模比较大，能够得到比较多的利妥昔单抗，与此

20、同时，得到的 利妥昔单抗原液的纯度比较高。尽管大规模生产利妥昔单抗原液需要投资更多成 本，但高年产量和高纯度带来的利润收入远高于成本投入。另外，在设计上、下 游工艺时，根据低成本、高效率的准则，选用了流加式细胞培养和选用亲和层析 法进行利妥昔单抗的捕获，阳离子交换层析和阴离子交换层析进行抗体的精纯， 保证了产量和纯度的同时，提高了经济效益。因此，综上所述，在利妥昔单抗需求量大的背景下，本项目具有非常良好的 市场前景，不仅能够带来巨大的经济效益，也能够为国内生物制品的深入研究提 供帮助。第二章 工艺流程设计2.1生产利妥昔单抗的质量标准根据中国药典2015 版规定，生产人用重组单克隆抗体制品所使

21、用的原 材料和辅料应符合相关要求，并且其中的细胞株的来源、管理及检定应符合“生 物制品生产检定用菌毒种管理规程”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备 及检定规程”的相关要求。在细胞培养和收获阶段，应采用适当的体外方法至少 对三次收获物进行外源病毒检测，如检测到任何外源病毒，应停止收获并废弃同 一细胞培养的前期收获液，追溯并确定污染的来源9。本设计中，工程细胞株利用基因工程方法重组构建，符合中国药典 2015 版的规定，能够投入工厂进行大规模培养使用。2.2 生产工艺流程2.2.1 细胞培养从液氮中将冻存着细胞株的冻存管取出，同时放入37C的恒温水浴锅中进 行水浴加热，约3分钟后从水浴锅中取出

22、，完成细胞株的复苏。接种3xlO5cells/mL的密度接种至含有50mL的DynamisTM AGTtm培养基（赛 默飞公司）的250mL摇瓶中，另加入4mM L-Glutamine （赛默飞公司）放置于 条件为37C, 5%CO2的培养箱中，150rpm摇床培养23天，使摇瓶中细胞密度 生长到 1.0X1063.0X106cells/mL。2.2.1.2 传代培养将250mL摇瓶中的密度为2.0X106cells/mL的细胞，以1:5的体积比例稀释 到含有 1.6L DynamisTM AGTTM 培养基的 2L 细胞罐中，再另外加入 4mM L-Glutamine进行细胞的扩大培养，工艺

23、条件为温度37C, pH控制在7.00.2, DO控制在40%，搅拌速度为200rpm，培养23天，使2L罐中细胞密度生长到 2.0X106cells/mL。后将2L罐中细胞密度生长到2.0X106cells/mL的细胞以1:5的体积比例稀释 到含有8L DynamisTM AGTtm培养基的10L细胞罐中，另加入4mM L-Glutamine 进行扩大培养，工艺条件为温度37C, pH控制在7.00.2，同时与NaHCO3偶 联，DO控制在40%，搅拌速度为120rpm，使10L罐中细胞密度生长到2.0X 106cells/mL。再将10L罐中细胞密度生长到1.0X 1063.0X 106c

24、ells/mL的细胞以1:5的体 积比例稀释到含有40L DynamisTM AGTtm培养基的100L细胞罐中（接种后体积 为50L），另加入4mM L-Glutamine，工艺条件为温度37C，pH控制在7.00.2, DO控制在40%，搅拌速度为75rpm，在培养的第四和第六天各补料培养基 EfficientFeedC AGT 补充剂（赛默飞公司）一次，各5L,补料后总体积为60L。 细胞培养的第 78 天，此阶段细胞进入对数生长期，此时的细胞密度为 1.7X 1071.9X 107cells/mL,收集此时的细胞作为种子细胞并转移到2000L发酵罐中进 行发酵。以接种量为 2.0X 1

25、06cells/mL 接种到装有 500L 基础培养基 DynamisTM AGTtm培养基的2000L发酵罐中，另加入4mM的L-Glutamine,培养温度为37C, 使用7.5%的Na2CO3调整pH为7.0, 5%的CO2, DO初设定为100%，在培养的第一天和第二天补加基础培养基250L，同时各添加4mM L-Glutamine,在培养 的第三天加入当天培养体积15% （即150L）的EfficientFeedTMC AGT补卜充剂， 第四天加入当天培养体积12.5% （即140L）的EfficientFeedTMC AGT卜卜充剂， 第六天和第八天分别加入当天培养体积3% （即各

26、添加38L和40L ）的EfficientFeedTMC AGT补充剂，第九天至第十四天分别加入当天培养体积2% （即分别添加 27L、27L、28L、30L、30L、30L）的 EfficientFeedC AGT补 充剂，到第十五天收获目标产物利妥昔单抗12。整个过程控制在40%60%,控制葡萄糖浓度为0.53g/L,添加2%的泡敌作 为消泡剂，转速为 100r/min 进行分批流加补料方式进行细胞培养，待细胞活率 低于85%时，停止发酵，发酵15天为1周期。2.2.2 产品纯化将细胞培养液经过BTPX 710自动分离离心机（Alfa Laval）进行细胞和细 胞碎片的分离，后将分离出来的

27、发酵液连续滤过Advanta系列的 ALT13G23CBH4滤器（Pall Corporation）以达到深层过滤的效果，为后续的精纯 做好准备。2.2.2.1 亲和层析将收集到的上清液经过亲和层析柱进行利妥昔单抗的捕获。利用 Protein A 和利妥昔单抗的特异性结合，将上清液中的利妥昔单抗分离纯化出来。使用 GE 公司的KTA avant150层析系统，使用型号为BPG-450/1000色谱柱（GE），采 用Mabselect （GE）作为填料，介质的上样载量为30mg/mL，而上清液中利妥昔 单抗含量为2g/L，发酵液经离心后，有少量损失，此处为方便计算，忽略不计， 因此上清液体积为1

28、600L，利妥昔单抗含量为3200g，理论上需要添加约106.7L 的填料，为避免造成产物流失，因此约添加135L的填料进行亲和层析，整个过 程中操作流速设置为 500cm/h。待抗体吸附完毕后，用40mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4缓冲液进行平 衡层析柱。用平衡缓冲液（2CV）、40mM磷酸钠、1.5M NaCl、2M尿素、10mM EDTA、 pH7.4 洗涤，去除与介质或抗体弱结合的杂质，再用 100mM 柠檬酸钠 （2CV）、pH3.5进行洗脱，洗脱Protein A上结合的抗体。最后通过连续用（i） 0.2M NaOH （2CV）、（ii） WFI （注射用水，2CV）、

29、3.5%乙酸、100mM 硫酸 钠（2CV）、（iii） WFI （2CV）反向洗涤Mabselect树脂，进行介质再生。2222低pH孵育在亲和层析后，向收集到的低pH洗脱液中加入少量的100mM柠檬酸钠， 调整其pH为3.5,进入病毒灭活罐中，在2024C下以65r/min的速度搅拌60min， 再使用50mM NaOH调节pH至4.5，为随后的阳离子交换层析步骤提供起始条 件。但是低pH孵育对鼠细小病毒等无包膜病毒没有明显的灭活效果13,因此后 续仍要进行病毒的灭活过滤才能得到最终的原液。2.2.2.3阳离子交换层析由于一般抗体等电点在8.09.0之间，而一般CHO (中国仓鼠卵巢细胞)

30、宿 主细胞蛋白等电点在5.07.0之间。因此，调整样品的pH为7.5，使利妥昔单抗 带正电荷， CHO 宿主细胞蛋白带负电荷，目的是使得利妥昔单抗由于静电力的 作用被吸附在阳离子交换层析柱上，而杂蛋白流穿出阳离子交换层析柱。使用型 号为BPG-450/500色谱柱(GE)，采用Capto S ImpAct (GE)作为阳离子交换 树脂填料，载量为100mg/mL，理论上需要添加约32L的填料，根据经验，需再 多添加80%的填料以免造成产物流失，即装入40L树脂，用WFI (1CV)洗涤 柱，待抗体加载完毕后，然后进行梯度洗脱，通过按以下比例和顺序混合20mM 柠檬酸钠pH5.5 (缓冲液A)和

31、40mM柠檬酸钠pH7.8 (缓冲液B)来形成梯度:(i) 100%A (0.2CV)；(ii)线性梯度至 40%A+60%B (2CV)；(iii)线性 梯度至100%B (6CV)；(iv) 100%B (2CV)。将吸附在阳离子交换层析柱上 的抗体用洗脱液洗脱出来，反复洗脱至利妥昔单抗被完全洗脱出来，以提高回收 率。最后通过连续用(i) 2M NaCl (1CV)和(ii) 1M NaOH (2CV)来对 Capto S ImpAct 进行介质再生。整个过程中流速设置为 300cm/h。另外，虽然细胞培养液中存在少量蛋白酶，可能使得Protein A脱落，成为 杂蛋白，但由于蛋白酶的数量

32、是微量的，故其造成的杂质影响忽略不计。 2.2.2.4阴离子交换层析通过阳离子交换层析， CHO 宿主细胞蛋白基本上被去除，因此通过阴离子 交换层析将残留的CHO宿主蛋白去除，同时也去除细胞的残留DNA碎片。而 核酸的等电点比较低，因此，调整样品的pH为7.5，使利妥昔单抗带正电荷， 其余杂质带负电荷，目的是使得其余杂质被吸附在阴离子交换层析柱上，利妥昔 单抗流穿出层析柱，从而达到精纯的效果。使用型号为BPG-200/750色谱柱(GE)，采用Capto Q (GE)作为阴离子 交换树脂填料，以250g蛋白质/L树脂的负荷，理论上需要添加约12.8L的填料, 根据经验，需再多添加80%的填料以

33、免造成产物流失，即装入16L树脂通过层 析柱，整个过程中流速设置为300cm/h。用20mM磷酸钠、100mM NaCl、pH7.8 缓冲液缓冲液反复清洗，使得利妥昔单抗完全流穿出层析柱，减少损失，提高回 收率。最后连续用(i) 100mM 柠檬酸、2M NaCl (2CV)、(ii) 2M NaCl (1CV)、 (iii) 1M NaOH (2CV)和(iv) 10mM NaOH (2CV)洗涤 Capto Q 进行树脂再 生。此时，CHO宿主蛋白等杂蛋白、细胞核酸碎片等杂质已经基本上被去除， 即此时得到的是高纯度的利妥昔单抗。2225病毒的过滤、UF/DF由于低pH孵育，一些无包膜结构的

34、病毒和细小病毒无去除灭活作用，因此 仍需要进行病毒的过滤才能将病毒去除。将上一步得到的流穿物通过孔隙大小为20nm的PegasusTMPrime除病毒囊式 滤器(Pall Corporation)，收集在 UF/DF 设备罐中，并用 Omega Centrasette 膜 包(Pall Corporation，30KD)，浓缩至约10g/L，将浓缩产品转移至可移动罐， 将罐放置在层状气流下，加入吐温80至终浓度约为0.1% (w/w)。最后用0.2pm Mini Kleenpak囊式滤器(Pall Corporation)进行除菌过滤，达到进一步净化和分 离的效果，从而得到高纯度的利妥昔单抗原

35、液14。第三章 工艺计算31物料平衡计算一年按365天算，生产天数为300天，发酵一次以15天(360小时)计算， 一个生产周期前后包括种子培养、纯化等过程近1 个月的时间，我们以发酵罐使 用时间进行排产，设计20天为一个发酵周期，一年下来共有15个生产周期。由于发酵罐体积为2000L，发酵液体积按罐体积的4计算，即发酵液体积为：4V 二 2000 x 二 1600L05利妥昔单抗表达量以2g/L计算，经过15天发酵，一次能够生产约3200g的 利妥昔单抗。由工艺流程可知，发酵液量 V0 由 3 部分组成：底料V 二 1000L1种子液V二60L2补料量(发酵第 314天)V =(150+14

36、0+38 + 40+27 + 27 + 28 + 30+30 + 30) L = 540L3( 1 )消耗培养基总量根据产品说明书知 DynamisTMAGTTM 培养基的添加量为 24.8g/L， EfficientFeedTMC AGT培养基的添加量为 81.2g/L，则基础培养基(DynamisTMAGTTM培养基)消耗量：V (基础培养基)=(0.05 + 1.6+8+40+500+250+250) L=1049.65LM1= (24.8X1049.65) g=26031.32g则一年需消耗基础培养基的量为：M1=(26031.32X15) g=390469.8g 补料培养基(Effi

37、cientFeedTMCAGT)消耗量：V (补料培养基)=(5 + 5 + 540) L=550LM2= (81.2X550) g=44660g则一年需消耗补料培养基的量为：M2=(44660X15) g=669900g( 2)消耗 L-Glutamine 总量在每步添加基础培养基后，都添加 4mM L-Glutamine15：M(L-Glutamine) =(4X10-3X1049.65) g=4.1986g 则一年消耗M(L-Glutamine) =(4.1986X15) g=62.979g(3) 消耗层析填料总量根据经验，为避免造成产物的损失，添加上样量设置为填料量的 80%，即Mab

38、select 亲和层析树脂 m=106.7LF80%=135L则一年消耗Mabselect亲和层析树脂：m1=(135X15) L=2025LCapto S ImpAct 阳离子交换树脂 m2=32LF80%=40L则一年消耗Capto S ImpAct阳离子交换树脂：m2=(40X15) L=600LCapto Q 阴离子交换树脂 m3=12.8LF80%=16L则一年消耗Capto Q阴离子交换树脂：m3=(16X15) L=240L(4) 消耗缓冲液总量质量与物质的量关系公式：m = n x M其中m物质的质量gn物质的量molM物质的摩尔质量g/mol磷酸钠的消耗量在亲和层析的缓冲液配

39、方中，使用到两次 40mM 的磷酸钠，则m (40mM 磷酸钠)=(0.04X270X164) gX2=3542.4g在阴离子交换层析中，使用到 20mM 的磷酸钠，则m(20mM 磷酸钠) =(0.02X32X164) g=104.96gM (磷酸钠)=3542.4g+104.96g=3647.36gNaCl 的消耗量在亲和层析的缓冲液配方中，使用到150mM NaCl和1.5M NaCl,在阳离子 交换层析的缓冲液配方中，使用到2M NaCl，在阴离子交换层析的缓冲液配 方中，使用到2M NaCl和150mM NaCl，则m(100mM NaCl) =(0.1X32X58.4) g=186

40、.88gm(150mM NaCl) =(0.15X270X58.4) g=2365.2gm(1.5M NaCl) =(1.5X270X58.4) g=23652gm( 2M NaCl) =( 2X 32X 58.4) g+( 2X 40X 58.4) g=8409.6gM(NaCl) =(186.88+2365.2+23652+8409.6) g=34613.68g尿素的消耗量在亲和层析的缓冲液配方中，使用到 2M 尿素，则M( 2M 尿素) =( 2X 270X 60) g=32400gEDTA的消耗量在亲和层析的缓冲液配方中，使用到 10mM EDTA 尿素，则M(10mM EDTA) =

41、(0.01X270X292.2) g=788.94g柠檬酸钠消耗量在亲和层析的缓冲液配方中，使用到 100mM 柠檬酸钠，阳离子交换层析用 到A溶液20mM柠檬酸钠，B溶液40mM柠檬酸钠，则m(100mM 柠檬酸钠) =(0.1X270X294.1) g=7940.7gm(20mM 柠檬酸钠) =(0.02X8X294.1)+(0.02X32X294.1) g=235.28g m( 40mM 柠檬酸钠) =(0.04X48X294.1) +(0.04X240X294.1) +(0.04X80X294.1) g=4329.152gM (柠檬酸钠)=(7940.7+235.28+4329.152

42、) g=12505.132gNaOH消耗量在亲和层析的缓冲液配方中，使用到0.2M NaOH,阳离子交换层析的缓冲 液配方中使用到1M NaOH,阴离子交换层析的缓冲液配方中使用到1M NaOH 和 10mM NaOH，贝Vm(0.2M NaOH) =(0.2X270X40) g=2160gm(1M NaOH) =(1X80X40) +(1X32X40) g=4480gm(10mM NaOH) =(0.01X32X40) g=12.8gM(NaOH)=(2160+4480+12.8)g=6652.8g硫酸钠消耗量 在亲和层析的缓冲液配方中，使用到 100mM 硫酸钠，则M (lOOmM 硫酸钠

43、)=(0.1X270X142) g=3834g 柠檬酸消耗量 在阴离子交换层析的缓冲液配方中，使用到 100mM 柠檬酸，则M(100mM 柠檬酸) =(0.1X32X192.1) g=614.72g综上：物料名称消耗物料量/周期消耗物料量/年产量/周期产量/年DynamisTMAGTTM培养基/kgEfficientFeedCAGT培养基/kgL-Glutamine/gMabselect 亲和层析树脂/LCapto S ImpAct 阳离子交换树脂/LCapto Q 阴离子交换树脂/L磷酸钠/kgNaCl/kg尿素/kgEDTA/kg柠檬酸钠/kgNaOH/kg硫酸钠/kg柠檬酸/kg利妥昔

44、单抗/g26.03132390.4698g44.660669.900 4.198662.9791352025 40600 162403.6473654.710434.61368519.2052 32.44860.7889411.834112.505132187.576986.652899.7923.83457.5100.614729.2208 320048000表1：生产利妥昔单抗原液物料平衡表3.2 热量平衡计算热量公式Q 二 me (t -1 )21式中m物料质量(kg)e物料比热容kJ/ (kgC) t2物料加热前后的温度(C)根据生产利妥昔单抗原液的物料衡算表，可知生产一周期需消耗培养

45、基共1977.65L,生产一年需消耗培养基33620.05L,为方便计算，培养基的比热容、 密度按水的比热容计算，即：P =1 kg/L，e =4.2X 103kJ/ (kg C)水水生产一周期加热培养基所需热量(水的初温按20C计算)Q =1X1977.65X1X(37-20)=33620.05 kJ周期则生产一年所消耗的热量为Q =(33620.05X15)kJ=504300.75 kJ年3.3水平衡计算由于采用的是Xcellerex XDR 次性生物反应器系统(GE公司)，内置一 次性塑料袋，免去清洗操作，下一次生产可直接使用，因此种子罐和发酵罐的清 洗用水视为 0。培养基用水(纯化水)

46、 V=(0.051.6+8+40+10+1000+540)L=1599.65L纯化过程用水(注射用水)V( WFI)=( 270+270+40)L=580L 清洗层析柱及其他用具用水(自来水) 为方便计算，且以少量多次为原则，清洗一次用水量以层析柱最大容积计算V (清洗)=(0.25 + 115.6+65.6+21) L=202.45L 即一年消耗水总量V =(1599.65+580+202.45)LX15=35731.5L总3.4耗冷量计算在进入下游纯化精制工艺时，为保证利妥昔单抗的活性，需要将利妥昔单抗 的温度降至为约4C,因此需要耗冷。耗冷量计算公式16：me(t -t )Q 二12-冷

47、T式中m物料的质量(kg)c物料的比热容kJ/ (kgC) t1物料冷却前的温度(C) t2物料冷却后的温度(C)t工艺规定的冷却过程时间(h)则已知发酵一次得到的发酵液总量为1600L,密度和比热容按水的密度和比 热容计算为p =1 kg/L, c =4.2X103kJ/ (kg C),故发酵液的质量为：水水m=pV=(1X1600) kg=1600kg工艺要求在0.5h内完成冷却过程，则所耗冷量为：mc(t -t )12-T1600 x 4.2 x103 x(37-4)05=4.4352X108(kJ/h)则年耗冷量为Q =(4.4352X108X480X15) =3.193344X101

48、2 kJ冷第四章 设备选型4.1 设备选型的原则( 1)保证生产过程中,设备安全可靠,耐用耐腐蚀( 2)操作方便,在市场上容易采购 (3)设备的性价比高,实用性强4.2 设备选型根据本设计所确定的生产工艺流程,利妥昔单抗原液生产设备主要有：细胞 培养设备、离心设备、过滤设备、层析纯化设备、病毒过滤设备。1. 种子罐、发酵罐采用Xcellerex XDR 10 一次性搅拌罐生物反应器(GE公司)进行传代培养 阶段的种子罐,根据工艺流程可知,需要 2L、10L 的种子罐进行扩大培养,因 此需要各 1 个。采用Xcellerex XDR 一次性生物反应器系统(GE公司)进行扩大培养和发 酵，容积分别

49、为100L、2000L，各1台。2. 离心、过滤设备采用BTPX 710自动分离离心机(Alfa Laval)进行细胞和细胞碎片的分离, 后将分离出来的发酵液连续滤过Advanta系列的ALT13G23CBH4滤器(Pall Corporation)以达到深层过滤，则所需离心机数量为1,滤器数量为2。3. 层析系统采用GE公司的KTA avantl50层析系统来连接下游工艺各层析步骤，数量为 1 台。4. 层析柱使用BPG-450/1000色谱柱（GE）作为亲和层析柱,BPG-100/950色谱柱（GE） 作为阳离子交换层析柱，BPG-200/750色谱柱（GE）作为阴离子交换层析柱进 行下游

50、工艺的精纯。所需数量各为1个。5. 病毒过滤器采用PegasusTMPrime除病毒囊式滤器（Pall Corporation）对精纯完成的原 液进行病毒过滤，为后续进入 UF/DF 做准备。6. UF/DF 设备罐采用UniFlux切向流过滤系统（GE），并使用Omega Centrasette膜包（Pall Corporation， 30KD）进行病毒的过滤，数量为1台。7. CO2 培养箱采用型号为 Heracell VIOS 250i （Thermo Fisher Scientific），容量为255L 的 CO2培养箱进行培养，数量为1台。8. 灭菌设备整个生产流程中的干热灭菌器采用

51、型号为 DMH-12 的双扉干热灭菌柜（南 京鑫长江制药设备有限公司），湿热灭菌柜采用型号为12622的Sterivap脉动真 空灭菌柜（德国MMM公司），数量各为1台。9. 制水设备 在整个生产流程中，采用纯化水制备设备（沃萃特（广州）水处理设备有限 公司），采用注射用水制备设备（山东潍坊精鹰医疗器械有限公司）进行制水， 数量各为 1 台。一次性搅拌罐生物反应器Xcellerex XDR102L一次性搅拌罐生物反应器Xcellerex XDR1010L一次性生物反应器系统Xcellerex XDR100LXcellerex XDR一次性生物反应器系统定制2000LKTAavant150 层析

52、系统KTAavant 150流量最大为1500mL/m in, 最大工作压力为5MPaBPG色谱柱BPG-450/1000尺寸为800 X 800 X1900mm，最大床体积为115.6LBPG色谱柱BPG-450/500尺寸为800 X 800 X1400mm，最大床体积为65.6L10BPG色谱柱BPG-200/750尺寸为590 X 590 X1520mm，最大床体积为21LGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcare

53、LifeSciencesGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcareLifeSciencesGEHealthcareLifeSciences11PegasusTMPrime 除病毒囊式滤 器NT8UPRMP1S孔隙大小为20nm,高度为0.762m1PallCorporation012UniFlux切向流过滤系统定制1GEHealthcareLife Sciences413co2培养箱Heracell VIOS250i容量为255L1ThermoFisherScientific1 1n14双扉干热灭菌 柜DMH-12腔室尺寸：宽2.5m深3m,高 1.6m； 外形尺

54、寸：宽3.6m, 深 3.35m 高 2.7m；功率：130kw1南京鑫长江 制药设备有 限公司hl15Sterivap脉动真 空灭菌柜12622内部尺寸mm： 1360X 720X2100 容积：2056L 外部尺寸mm： 2100X 2100X24601德国MMM公司16纯化水设备产水能力250L/h5000L/h1沃萃特（广 州）水处理 设备有限公 司Mi 陳17不锈钢注射用 水生产设备产水能力100L/h1山东潍坊精 鹰医疗器械 有限公司1表 2 ：设备一览表第五章 车间布置设计5.1设计原则单克隆抗体的生产有以下特点：生产周期长、需要有非常严格的预防病毒污 染的设备和措施，而且在单抗

55、的生产过程中为了保持单抗的最高活性，温度需要 严格控制等。由于上游生产区（从种子培养到收获）有生物活性，而下游生产区 （从纯化到原液收获）没有生物活性，因此两区域需分开，避免交叉污染 17 。 其中，上游工艺涉及种子复苏等敞口操作，需要在层流保护下进行，并且该生产 区域与其他操作活动分开。种子扩增阶段采用密闭的一次性生物反应器，降低了 产品污染风险。下游工艺也涉及多步纯化和过滤工序，也采用密闭系统，最终原 液产品的过滤在层流保护下进行。另外，车间布置遵循相关法规规范。其中，在新版GMP要求中，对无菌产 品生产的洁净度提出了具体的要求对洁净区进行分级，为 A、B、C、D 四 个分级标准，具体如下

56、表：静态动态级别尘粒最大允许数/m30.5ym5ym0.5ym5ymA3500135001B350013500002000C3500002000350000020000D350000020000不作规定不作规定综上，车间布置设计遵循的原则概括为以下方面：（1）设备走向满足工艺流程走向，主要设备排布协调整齐。（2）特别要考虑物料特性对防火、防爆、防毒和控制噪音的要求。（3）人流物流分开，避免产生交叉污染。（4）设备与设备之间，设备与建筑物之间的安全距离18列于下表19项目安全距离（m）（1）回转机械与墙之间距离不小于0.81.0（2）泵的间距不小于1.0（3）反应设备上传动装置高天花板间距不小于

57、0.8（ 4）操作台楼梯坡度一般不大于45（5）通廊，操作台通行部分的最小净空高度不小于2.0（6）不常通行的地方净咼不小于1.9表 3 ：车间设备安全距离一览表5.2 车间布置设计由于上游生产区的产品具有细胞活性，则设置独立的人流通道，与下游生产 区的人员分开。同时，设计为C级洁净区走廊，路线简洁通畅，不迂回。另外， 生产人员经过各自的更衣通道进入生产操作岗位，再从返回走道退出，最大程度 避免交叉污染，保障产品生产的背景环境。而下游生产区需要经过多步的层析进行精纯，操作较为复杂，生产周期较短， 批次更换和清场频繁，因此背景环境较上游生产区更为严格，需特别注意避免产 品污染和交叉污染，以保证最

58、终利妥昔单抗原液的安全性20。5.3 车间布置图具体车间平面布置图见附录。参考文献1 刘伯宁，阚红金，白玉，罗建辉.关于利妥昔单抗生物类似药“质量相似性”评价 标准的探讨J.药学学报，2019, 54(1)： 2118-2125.2 杨厚赐，徐领城，黄育文我院2010-2012年靶向抗肿瘤药利用分析J.中国药房， 2014，25(06)：512-515.3 毕锡文，陈廷超.利妥昔单抗在淋巴瘤维持治疗中的新进展J.中国肿瘤临床， 2014，41(24)：1612-1615.4 李英.利妥昔单抗在特发性膜性肾病中的应用J 肾脏病与透析肾移植杂志， 2017，26(1)：54-55.5 世界医疗科技

59、资讯.首个国产生物类似药利妥昔(汉利康)单抗获批上市！治疗非 霍奇金细胞瘤EB/0L.h tt ps:/6 医药地理. 复宏汉霖利妥昔单抗价格由 1640 元调整为 1398 元 降幅达 15%EB/OL.7 健康时报网抗癌药持续调价，国产淋巴瘤药物汉利康 零售价再降300元 EB/OL. -028 界 面 新 闻 . 对 垒 美 罗 华 ， 复 宏 汉 霖 利 妥 昔 单 抗 再 降 价 EB/OL. 2019-08-02.9 付平，苟慎菊.利妥昔单抗在肾脏疾病中的应用J.肾脏病与透析肾移植杂志, 2017，26(1)：50-51.10 抗 体 圈 . 单 克 隆 抗 体 大 规 模 生 产 的 产 能 、 成 本 与 经 济 学EB/OL.11 国 家 药 典 委 员 会 . 人 用 重 组 单 克 隆 抗 体 制 品 总 论 EB/OL12 周凯松，王庆民，孙丽霞，曹平，夏庭坤，崔午阳.一种大规模哺乳动物工程细胞 培养方法P.中国专利：103320390,2013-09-25.13 同 写 意 . 抗 体 纯 化 第 四 话 ： 病 毒 如 何 去 除 与 灭 活 EB/OL14 吉 瑞 工 厂 . 使 用 预 清 洗 步 骤 的 免 疫 球 蛋 白 纯 化 P. 中 国 专 利 ：