NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究

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1、NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及 机制研究 中南大学湘雅三医院 黄 东 教授 目前 ， 全球癌症患者的数量呈 骨 癌痛的具体机制 癌性疼痛成为影响癌症病人生活 质量的一个严重问题。 在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制。 临床上，癌痛表现为进行性加重，常伴 随有爆发痛； 癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不 同的外周和中枢机制 1 。 如癌痛：胶质细胞增生肥大； GFAP 1 : Honore P. Neuroscience, 2000, 98: 585598. NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化 的基础 ， 是持续性疼痛产生和维持的关键 2 。 大量研究证实： NMDA受体的亚基 N

2、R2B在炎性痛 、 神经病理痛中参与了伤害性信息传递 ， 在疼痛调 制及痛觉敏化 的形成和维持中发挥重要作用 3 。 2 : Petrenko. Anesth Analg. 2003, 97(4): 1108-1116. 3 : Nagy GG. Eur J Neurosci, 2004, 20 (12): 3301 - 3312. （一） 研究显示 ， MAPK信号通路在神经可塑性和炎症 反应的细胞信号转导过程中起重要作用 4 。 增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸 性蛋白 （ GFAP） ， 骨癌痛的产生和维持与脊髓 星形胶质细胞结构和功能的变化密切相关 1 。 4 : De Le

3、o JA. Pain, 2006, 122 (122): 17221. （二） 研究癌痛的确切机制 ， 需要适当的动物模型 ， 现有动物模型仍显不足 。 肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤 ， 且小鼠在肿瘤 学及神经系统研究方面具有独特的优势 。 小鼠作为实验模型 ， 较经济适用 本实验参照 Schwei等的方法 ， 将 Lewis肺癌细胞接种 于 C57BL/6小鼠股骨骨髓腔 ， 建立一个全新的骨癌痛 模型 。 我们从如下四个方面加以研究： 1、建立一个小鼠骨癌痛新模型 2、 NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分 布与表达 3、 脊髓 NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响 4、 MAPK信号

4、通路介导的 NR2B在小鼠骨癌痛中 的作用机制 实施方案： 检测癌痛小鼠脊髓和前扣带回 NR2B的表达和分布 ， 分析小鼠 NR2B的表达和小鼠疼痛行为学关系 。 应用 RNA干扰技术 ， 沉默骨癌痛小鼠 NR2B基因； 通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠 NR2B的表达以 及两组小鼠疼痛行为学 ， 从而阐明 NR2B是否在癌 痛的发生与维持中起重要作用 。 对比骨癌痛小鼠 NR2B基因沉默前后 ， MAPK 信号 通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变； 研究 MAPK 信号通路中信号分子表达的相应改变与 GFAP的关联性； 探索 MAPK信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机 制 。 选用清洁级

5、雄性 C57BL/6小鼠 模型组 一般情 况观察 行为学 测定 内容 1技术路线 热灭活组 PBS组 正常对照组 放射学 检查 组织学 检测 自发痛行 为观察 机械性触 诱发痛 选用清洁级雄性 C57BL/6小鼠 癌痛组 一般情 况观察 行为学 测定 内容 2技术路线 假手术组 正常对照组 实时定量 PCR 检测 NR2B的 表达 免疫组化检测 NR2B的表达 及分布 自发痛行 为观察 机械性触 诱发痛 Western Blot 检测 NR2B的 表达 选用清洁级雄性 C57BL/6小鼠 癌痛组 一般情 况观察 行为学 测定 内容 3技术路线 干扰组 干扰对照组 实时定量 PCR 检测 NR2

6、B的 表达 自发痛行 为观察 机械性触 诱发痛 Western Blot 检测 NR2B的 表达 选用清洁级雄性 C57BL/6小鼠 正常组 一般情 况观察 行为学 测定 内容 4技术路线 干扰组 干扰对照组 实时定量 PCR 检测 NR2B、 SP、 c-fos和 GFAP基因 的 表达 自发痛行 为观察 机械性触 诱发痛 Western Blot 检测 NR2B， p-ERK， p- p38和 GFAP 的表达 癌痛组 结 果 1. 体重和一般状况 图 1：观察期内各组小鼠体重的变化 2.行为学测试 图 2：自发痛行为观察 图 3：机械性触诱发痛测定 3. 放射学检测 图 4：模型组小鼠不

7、同时间段术侧股骨 X片结果 : A为肿瘤细胞接种前摄片； B为接种后第 7天； C为接种后第 15天； D为接种后第 23天。 4. 组织学观察 骨髓腔内可见较 多肿瘤细胞 骨髓腔内大量肿瘤细 胞浸润且骨小梁破坏 肿瘤细胞侵犯 周围肌肉 骨髓腔破坏 ， 肿 瘤细胞穿破骨组 织 A:接种第 7天模型组小鼠股骨切片 B:接种第 15天模型组小鼠股骨切片 C:1接种第 23天模型组小鼠股骨切片 C2:接种第 23天模型组小鼠股骨 周围肌肉组织病检结果 图 6：模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的 HE染色（ HE 400） 行为学 、 放射学 、 组织学三方面证实： C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种

8、Lewis肺癌细胞 ， 能成功制备小鼠骨癌痛模型 ， 且此模型稳定 、 重复 性好 ， 与人类骨癌痛高度相似 。 本研究我们首次选用来源广泛 、 致瘤作用强的 Lewis肺癌细胞 ， 接种于 C57BL/6小鼠股骨骨髓 腔 ， 建立了一个新的小鼠骨癌痛模型 。 5、实时荧光定量 PCR检测前扣带回和脊髓 NR2B的表达 前扣带回 NR2B的表达 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 6 10 14 18 22 术后天数（d） NR2B 相对表达量 癌痛组 假手术组 正常组 前脑扣带回 NR2BmRNA 相对表达量 脊髓 NR2B的表达 图 5：

9、脊髓 NR2BmRNA 相对表达量 NR2BmRNA的相对表达量 0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025 0.0003 0.00035 6d 10d 14d 18d 22d 天数 NR2BmRNA的相对表达量 癌痛组 假手术组 正常组 第 14天前扣带回 NR2B的表达 A癌痛组前扣带回 100倍； B癌痛组前扣带回区域 200倍 C正常组前扣带回 100倍； D正常组前扣带回区域 200倍 E假手术组前扣带回 100倍； F假手术组前扣带回区域 200倍 6、 免疫组化检测前扣带回和脊髓 NR2B的表达 前脑扣带回 NR2B的表达 L4-L6脊髓 NR

10、2B的表达 L4-L6脊髓 NR2B的表达（ 200倍） 术后第 14天， L4-L6脊髓 NR2B的表达 术后第 18天， L4-L6脊髓 NR2B的表达 癌痛组 假手术组 正常组 癌痛组 假手术组 正常组 L4-L6脊髓 NR2B的分布 癌痛组 正常组 假手术组 L4-L6脊髓 NR2B的分布（接种后 14天） 脊髓各层 NR2B表达量在中央导水管、背角浅层、前角依次增多 7、 Western Blot检测 L4-6段脊髓 NR2B的表达 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 A B C 组别 NR2B/GAPDH光密度比值 0 0.05 0.1

11、0.15 0.2 0.25 0.3 A B C 组别 NR2B/GAPDH光密度比值* 术后第 14天各组小鼠脊髓 NR2B 术后第 18天各组小鼠脊髓 NR2B 的表达， A: 癌痛组 B: 假手术组 C: 正常组 的表达， A: 癌痛组 B: 假手术组 C: 正常组 * 1、 癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中 NR2B表达均明显增加 ， 脊髓各层表达量由大到小依次为前角 、 背角浅层 、 中央导水管 周围；且癌痛组 NR2B表达上调的同时 ， 疼痛行为学也有相应 的改变 。 初步表明脊髓和前扣带回中的 NR2B表达增加与小鼠 骨癌痛产生和维持存在一定相关性 。 2、 同一癌痛模型中观察到 NR2

12、B在脊髓和前扣带回同时高 表达 ， 提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢 ， 而且有脑部中枢的参与 。 3、 本研究初次发现 NR2B在脊髓前角细胞表达呈强阳性 ， 为下一步研究提供了新的思路 。 NR2BmRNA相对表达量 0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025 0.0003 0.00035 13d 14d 15d 16d 18d 22d 天数 NR2BmRNA相对表达量 癌痛组 干扰组 干扰对照组 图 3： 癌痛组、干扰组和干扰对照组 小鼠脊髓 NR2BmRNA的相对表达量 8、实时荧光定量 PCR检测小鼠脊髓 L4-6节段 NR2B的表达

13、 9、 Western Blot检测小鼠脊髓 L4-6节段 NR2B的表达 NR2B/GAPDH光密 度比值 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A B C 组别 Rate of NR2B/GAPDH Western Blot检测接种术后第 14天 小鼠脊髓 L4-6节段 NR2B的表达 A:干扰组； B:干扰对照组； C:癌痛组 NR2B/GAPDH光密 度比值 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A B C 组别 Rate of NR2B/GAPDH NR2B GAPDH A B C * Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 L4-6节段 NR2

14、B的表达 A:干扰组； B:干扰对照组； C:癌痛组 NR2B GAPDH * 1、 PEI/NR2B-siRNA复合物鞘内注射后能使骨癌 痛小鼠脊髓中 NR2B的表达下调； 2、 骨癌痛小鼠脊髓中 NR2B的表达下调与小鼠疼 痛行为学减轻相一致 ， 进一步证明 NR2B在癌痛发 生过程中起重要作用 ， 可能是癌痛治疗的有效靶 点 。 10、实时荧光定量 PCR检测小鼠脊髓 NR2B、 SP 、 c-fos和 GFAP基因 的表达 0.00E+00 5.00E-02 1.00E-01 1.50E-01 2.00E-01 2.50E-01 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 组别 相对表达量 N

15、R2B c-fos SP GFAP 接种术后第 14天，实时荧光定量 PCR检测各组小鼠脊髓 NR2B、 SP、 GFAP、 c-fos的相对表达量 注：图示中 NR2B组放大 100倍， c-fos放大 10倍 11、实时荧光定量 PCR检测小鼠脊髓 NR2B、 SP 、 c-fos和 GFAP基因 的表达 接种术后第 18天，实时荧光定量 PCR检测各组小鼠脊髓 NR2B、 SP、 GFAP、 c-fos的相对表达量 注：图示中 NR2B和 c-fos组均放大 100倍 图 5： Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 NR2B的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C:

16、 干扰组； D: 干扰对照组 * 图 6： Western Blot检测接种术后第 14天 小鼠脊髓 p-ERK的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 3.1 接种术后第 14天，检测 NR2B和 p-ERK蛋白表达 NR2B GAPDH 0 0.5 1 1.5 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 NR2B/GAPDH的 值 p-ERK GAPDH 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 P-ERK/GAPDH的 值 * 12、 Western Blot检测接种术后第 14天 小鼠脊髓 的 NR2B， p-ERK ， p

17、-p38和 GFAP蛋白表达 Western Blot检测接种术后第 14天 小鼠脊髓 p-p38的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 * Western Blot检测接种术后第 14天 小鼠脊髓 GFAP的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 * 13、接种术后第 14天，检测 p-p38和 GFAP蛋白表达 GAPDH 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 P-P38/GAPDH的 值 GFAP GAPDH 0 0.5 1 1.5 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照

18、组 GFAP/GAPDH的 值 Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 NR2B的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 p-ERK的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 接种术后第 18天，检测 NR2B和 p-ERK蛋白表达 14、 Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 的 NR2B， p-ERK ， p-p38和 GFAP蛋白表达 NR2B GAPDH 0 0.2 0.4 0.6 0.8 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 NR

19、2B/GAPDH的 值 p-ERK GAPDH 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 P-ERK/GAPDH的 值* * Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 p-p38的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 Western Blot检测接种术后第 18天 小鼠脊髓 GFAP的表达 A: 正常组； B: 癌痛组； C: 干扰组； D: 干扰对照组 接种术后第 18天，检测 p-p38和 GFAP蛋白表达 p-p38 GAPDH 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 正常组 癌痛组

20、干扰组 干扰对照组 P-P38/GAPDH的 值 GFAP GAPDH 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 正常组 癌痛组 干扰组 干扰对照组 GFAP/GAPDH的 值 * * 1） 癌痛小鼠的 MAPK通路中相应信号分子 p-ERK、 p- p38、 c-fos表达明显上调；而 NR2B的沉默可以下调 MAPK通路中相应信号分子 p-ERK、 p-p38、 c-fos表 达； 2） GFAP在 癌痛小鼠中高表达 ， 同时 NR2B的调控可 以影响 GFAP的 表达； 解除 Mg2+ 对 NMDA受体离 子通道的阻断作用 结合到突触后膜上配体门控离子型谷氨 酸受体 AMP

21、A受体， Na+内流 NMDA受体激活， Ca2+内流增加 激活 ERK， p38 c-fos转录因子 激活 NR2B表达 伤害性信号传入脊髓背角 ，释放大量谷氨酸 SP表达 神经元下游相关 基因表达变化 神经胶质细胞 GFAP表达 结合到胶质细胞上 AMPA受体 激活 ERK， p38 直接导致胶质细胞内 的 GFAP大量表达 导致癌痛 我们推测癌痛产生的可能机制 结 论 1. C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接种 Lewis肺癌细胞能成功制 备小鼠骨癌痛新模型 ， 此模型与人类骨癌痛具有相似性； 2. NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表达 ， 且同一癌痛模型 中观察到 NR2B在 L4-L6段脊

22、髓和前扣带回同时高表达 ， 提 示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢 ， 而且 有脑部中枢参与； 3. 本研究初次发现 NR2B在癌痛模型的 L4-6段脊髓前角细 胞表达呈强阳性 ， 为下一步研究提供了新的思路； 结 论 4. PEI/NR2B-siRNA复合物能特异性的使骨癌痛小鼠脊髓 NR2B的表达明显下调；其表达下调与小鼠疼痛行为学减 轻相一致 ， 进一步证明 NR2B在骨癌痛发生过程中起重要 作用； 5. MAPK信号转导通路 （ ERK通路和 p38通路 ） 在骨癌痛小 鼠模型中被激活； NR2B参与了 MAPK信号通路介导的骨癌 痛的中枢敏化； 6. NR2B参与介导的骨癌痛可能与 GFAP的过表达相关 ， 其 机制有待进一步研究 。