富铁酵母生产实验室工艺

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1、项目三富铁酵母功能食品的研发一、项目背景硒、铁、锌等微量元素在维持人类和动物的正常生理代谢过程中起着重要作用，它们参 与或辅助机体代谢，是生物体内各种活性酶的重要组成成分。如果生物体内缺乏这些微量元 素，会导致一系列疾病的发生。铁是人体必需微量元素中含量最多的一种，总量约为45g。铁为血红蛋白与肌红蛋白、细胞色素A以及某些呼吸酶的成分，参与体内氧与二氧化 碳的转运、交换和组织呼吸过程。铁是人体必需的微量元素之一，也是比较容易缺乏的元素。 铁缺乏时对人体的影响：工作效率降低、学习能力下降，冷漠呆板；缺铁儿童易烦躁，抗感 染抵抗力下降。此外，常有出现心慌、气短、头晕、眼花、精力不集中。我国建议铁的

2、日供给量为：成年男子12mg，成年女子为18mg，孕妇、乳母为28mg。 其NOAEL为65mg。缺铁及缺铁性贫血是当今世界十分重要的世界性营养问题。据世界卫 生组织统计，约有30%的世界人口存在铁缺乏现象，而90%的贫血现象是由于铁缺乏所引 起。缺铁可导致机体内多种含铁酶活力降低，致使机体抵抗力下降，并诱发多种疾病，如贫 血性心脏病、舌炎、口角炎、皮肤干燥、指甲变形及各种感染性疾病和癌症等。但无机态的微量元素毒性较大，被机体吸收的水平很低，而有机态的微量元素能够被机 体迅速、安全的吸收，并且能够在动物体内较长时间存留和积累。微生物具有将无机盐形式 的微量元素转化为较易被人体和动物吸收利用的有

3、机物形式的能力。其中尤以富集微量元 素能力极强的酵母菌为国内外应用微生物学研究的热点。目前现有的其他铁营养强化剂存在着利用率低，对食物的风味产生不利影响等缺点。 重视。现存的普通口服铁剂由于铁离子对粘膜的刺激、胃肠道副作用较大，因而限制了其使 用。而制成缓释制剂后，可减少副作用，但由于铁的输送超越了铁吸收的主要部位十二指肠， 吸收率会随之下降。正是由于铁制剂存在的种种限制，研究低毒高效补铁剂一直是目前铁制 剂开发的方向。大量的研究证实酵母是一种较为理想的微量元素载体。富铁酵母是天然食品或饲料添加剂，具有稳定性好，吸收率高，安全性好，与食物中其 他成分协同配合性好，并具有良好的风味等优点。所以富

4、铁酵母作为强化食品的铁源是预 防铁缺乏和缺铁性贫血的一项行之有效的措施。酵母菌具有蛋白质含量高、营养丰富、易培养、生长期短等优点。研制富含微量元素的 功能性酵母可以强化营养价值，有着广泛的应用前景。国外Heg o c z ki等人报道的富 铁酵母中铁离子含量达到1 0 mg/g细胞。中国科学院微生物所的富铁酵母中铁离子含量 达至U 2 5 mg/g干细胞。在国外，富集微量元素的功能酵母已经应用于生产。目前国内饲料市场上富集微量元 素功能酵母的产品多为进口，国内关于富集微量元素功能酵母的研究多停留在实验室小试阶 段，生产的产品还比较少见。二、实验方法【培养基】YPD或YEPD，：，又叫酵母浸出粉

5、胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖 (YPD)琼脂培养基，用于酵母菌的培养。配方：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。配制方法：1、溶解10g酵母膏,20g蛋白胨于900ml水中，121度20min灭菌，2、加入100ml 20g葡萄糖，(葡糖糖溶液灭菌后加入)。注：葡萄糖，酵母提取液， 蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。3、硫酸亚铁FeSO4.7H2O储备溶液：含铁量为100mg/ m L（注意：是指含铁量而不 是硫酸亚铁的含量！），0.1 MPa、121度高压蒸汽灭菌20 min。【酵母细胞计数】酵母细胞培养液以无菌水适当稀释

6、后,用血球计数板常规操作计数。即：记录5个小方 格中的菌数，计算公式如下：5个小方格中的菌数X5X104X稀释倍数=菌数/mL。参见 微生物检验技术书中血球计数板的使用方法。【接种、培养发酵】每组做3瓶YPD液体培养基100mL,用250mL三角瓶装好，编号为1#、2#和3#。分别加入无菌的硫酸亚铁储备溶液，使含铁量分别为约1.0mg/ mL、1.2mg/ mL和1.4mg/ mL. 再分别接入酵母菌种子液，使酵母菌初始浓度为107108个/mL。【培养发酵】2 8 C，2 0 0转/ min摇瓶发酵，培养2 4 h48h收集菌体。【酵母浓度计算】血球计数板法算出发酵液中的细胞浓度。【菌体干重

7、（生物量）的测定】发酵液4000r/min离心10min，收集菌体，蒸馏水洗涤酵母泥，离心，反复三次，收 集菌体，置于干燥箱中6080C烘干至恒重，即可得每升培养液的菌体干重。【铁含量的测定】采用分光光度法即邻二氮菲比色法测定，曲线方程本次实验需要得到以下数据，进行实验评价：发酵产品中酵母细胞浓度： 个/mL生物量：每升培养液中含有的酵母干重（g/L ）。铁含量：每克干酵母吸附的铁量（mg/g ）。富集率=（菌体干重X菌体含铁量），加入铁量总铁含量（m g/L ）=生物量（g/L ） x铁含量（mg/g ）邻二氮菲比色法（检验产品铁含量）一、原理在PH29的溶液中，二价铁离子能与邻二氯菲生成稳

8、定的橙红色络合物，在510nm 有最大吸收，其吸光度与铁的含量成正比。邻二氮菲（o-ph）是测定微量铁的较好试剂。在pH=29的溶液中，试剂与Fe2+生成稳 定的红色配合物，其lgK 形=21.3，摩尔吸光系数& = . 1x104,其反应式如下：Fe2+ + &o-ph） Fe（o-ph）3红色配合物的最大吸收峰在510nm波长处。当铁为+3价时，可用盐酸羟胺还原，本 方法的选择性很高，相当于含铁量40倍的Sn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、SiO32-, 20倍 Cr3+、Mn2+、V（V）、PO43-, 5 倍 C02+、Cu2+等均不干扰测定。二、主要仪器及试剂1.721

9、 （或752）分光光度计，10mL吸量管，50mL比色管8支，1cm比色皿，瓷坩埚， 电炉，马弗炉。2（1）100四/mL的铁标准溶液：准确称取0.8634gNH4Fe（SO4）212H2O于烧杯中，加入 20mL1:1的HCl和少量水溶解后，定量转移至1升容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。所 得溶液含 Fe3+100pg/mLo（2） 10pg/ml的铁标准溶液：准确移取25.0mL 100四/mL的铁标准溶液于250mL容量瓶 中，加水稀释至刻度，摇匀。3. 邻二氮菲:0.15%（10-3mol/L）新配制的水溶液。称取1.5g邻二氮菲，先用510mL 95% 乙醇溶解，再用蒸馏水稀释到10

10、00mL。4. 盐酸羟胺：10%水溶液（临用时配制）5. 醋酸钠溶液1mol/L6. NaOH 1mol/L7. HCl 6 mol/L三、测定步骤1. 铁标准曲线绘制取6个50mL的容量瓶，分别加人10四mL-1铁标准溶液0.00、2.00、4.00、6.00、 8.00、10.00mL各加入10%的盐酸羟胺1.0mL,摇匀，2分钟后各加人0.15%邻二氮菲溶 液2.0ml、1mol-L-1NaAc5mL再分别用水稀释至刻度，摇匀。在510nm波长光处以1号容 量瓶中的溶液（试剂空白）为参比溶液，测定其它溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，铁含 量为横坐标作图，得到铁标准曲线。2. 待测溶液中铁

11、含量的测定吸取待测铁溶液5.00mL放入50mL容量瓶中，其它试剂加入量同上，然后测定其吸光 度。根据所测吸光度在铁标准曲线上找出对应的铁含量，并计算出原待测溶液中每毫升含铁 的微克数。Fe （口gmL-1）=标准曲线上求得的浓度（口gmL-1）x试液稀释倍数。编号012345样品10口g/mL 铁标准溶液（mL）0.02.04.06.08.010.0样品（mL）5.010.0盐酸溶液1mL盐酸羟胺1mL邻二氮菲2mL醋酸钠5mL定容至50mL测吸光度510nm、1cm、0 号调零。（4）计算500ml YPD培养基（假设铁含量1.2mg/ml富集率最高）6ml FeSO4.7H2OFe,ug

12、YPEG:除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD研发阶段少量生产实验1, 将10g蛋白胨溶解于200ml蒸馏水中，121 C灭菌20min2, 将5g酵母膏溶解于100ml蒸馏水中，121 C灭菌20min3, 将10g葡萄糖溶解于200ml蒸馏水中，121 C灭菌20min4, 把以上三者混合制成酵母膏胨葡萄糖培养基（LYPD培养 基）5, 硫酸亚铁溶液（FeSO4.7H2O）的制备：5g硫酸亚铁晶体溶 于100ml水中，0.1Mpa，121 C高压生气灭菌20min（制 成含铁量为100ml/ml的储备液）25ml酵母菌种子液28 C摇瓶培养48h发酵培养离心400

13、0r/min离心10min,去除上清液后加蒸馏水洗涤（收 集菌泥），再离心，反复3次于烘箱中6080 C至恒重（计算并记录生物量）用粉碎机制作成富铁酵母粉铁含量（邻二氮菲比法）半成品实验室用酵母菌种子液的制作流程：（需时两天）制备麦芽汁培养基（100ml ）配置好在 121 C高压蒸汽灭菌 20min接入酿酒酵母适量（无菌操作）培养增殖（保温箱中24h温度28 C）制备培养基YPD培养基500ml，分装到3个 250ml锥形瓶中，每个100ml，剩 200ml备用。硫酸亚铁溶液的制备：5g硫酸亚铁晶体溶 于100ml水中，0.1Mpa，121 C高压生气 灭菌20min （制成含铁量为100m

14、l/ml的储 备液）试剂及仪器：250ml锥形瓶3个、量筒、 试剂瓶1个最适铁浓度检验试验（图）接种 5ml酵母菌种子液于不同Fe2+浓度培养基中（量如图）100mlYPD培养基5ml种子液20 滴 FeSO4.7H2O 溶液(1.0mg/ml)100mlYPD培养基5ml种子液24 滴 FeSO4.7H2O 溶液(1.2 mg/ml)发酵培养恒温振荡培养（摇瓶）28 C, 24h48h离心（分 A、B、C）1, 发酵液4000r/min离心10min收集菌体2. 蒸馏水洗涤酵母泥离心，反复3次，收集菌体干燥（分 A、B、C）于干燥箱中6080 C干燥到恒重， 计算生物量（g酵母/L）粉碎（分 A、B、C）用粉碎机粉碎成富铁酵母粉测定铁含量（分 A、B、C）铁含量：加入的铁量一一杂质吸附的铁量一一酵母离心后培养液上清液的铁量用邻二氮菲选择酵母富集率最高的Fe2+浓度扩大生产