DNA复制是半保留式的课件

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1、16DNA复制复制12.1DNA复制是半保留式的复制是半保留式的12.2DNA复制是双向进行的复制是双向进行的12.3DNA聚合酶聚合酶III催化复制叉处的聚合反应催化复制叉处的聚合反应12.4DNA聚合酶聚合酶III同时催化两条链的合成同时催化两条链的合成12.5复制叉移动需要多蛋白复合物复制叉移动需要多蛋白复合物12.6DNA复制起始于细菌染色体上的唯一的一个部位复制起始于细菌染色体上的唯一的一个部位12.7DNA复制终止于复制终止于ter区区12.8DNA复制的其它方式复制的其它方式12.9损伤的损伤的DNA可以修复可以修复遗传中心法则遗传中心法则DNA复制复制RNA复制复制转录转录逆转

2、录逆转录翻译翻译蛋白质蛋白质 Meselson-Stahl实验：实验：1、使、使E.coli在含有唯一氮源在含有唯一氮源1515N N（1515NHNH4 4ClCl）的培养的培养基中培养，合成的所有核苷酸都含有基中培养，合成的所有核苷酸都含有15N，具有较高，具有较高的密度，都整合到亲代的密度，都整合到亲代DNA中。中。2、将生长在、将生长在15NH4Cl培养基的培养基的E.coli转移到含有唯一转移到含有唯一氮源，但密度较低的氮源，但密度较低的1414N N（1414NHNH4 4ClCl）培养基中培养。培养基中培养。培养两代，并分别取每一代的培养两代，并分别取每一代的DNA进行密度梯度离

3、进行密度梯度离心。心。12.1DNA复制方式是半保留式复制方式是半保留式首先在首先在1515NHNH4 4ClCl培养基中培养培养基中培养然后转到然后转到1414NHNH4 4ClCl培养基中培养培养基中培养只在只在1515NHNH4 4ClCl中培养中培养只在只在1414NHNH4 4ClCl中中培养培养1414N N对照系统对照系统对照系统对照系统1515N N对照系统对照系统对照系统对照系统第一代第一代第二代第二代提取提取DNA，进行密度梯度超离心，进行密度梯度超离心E.coli 细胞细胞用用1515N N标记的标记的亲本亲本DNA1414N N中第一中第一次复制次复制1414N N中第

4、二次复制中第二次复制实验结果表明实验结果表明DNA复制是半保留复制复制是半保留复制（a）密度梯度离心的）密度梯度离心的DNA带带（b）对应于左侧）对应于左侧DNA带的解释带的解释Meselson-stahl实验实验从前面图可以看出，在含有从前面图可以看出，在含有14N氮源介质中培养一氮源介质中培养一代的代的DNA经密度梯度离心后，经密度梯度离心后，DNA带位于在带位于在1515N N培养培养培养培养基中的基中的基中的基中的DNADNA带的上面。带的上面。带的上面。带的上面。在含有在含有14N氮源介质中培养两代后的氮源介质中培养两代后的DNA经密度梯经密度梯度离心后，出现两条带，第一条带位置与培

5、养一带的度离心后，出现两条带，第一条带位置与培养一带的DNA带相同，另一条带相同，另一条DNA带位于第一条带上面，说明带位于第一条带上面，说明第二条带密度更轻。第二条带密度更轻。实验结果充分说明实验结果充分说明DNADNA复制是半保留复制。复制是半保留复制。两种复制模式两种复制模式（a）单向复制模式）单向复制模式（b）双向复制模式）双向复制模式12.2DNA复制是双向进行的复制是双向进行的大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA双向复制模式双向复制模式复制复制起点起点复制叉复制叉复制叉复制叉真核生物真核生物DNA复制有多个复制起点，同时双向复制复制有多个复制起点，同时双向复制DNA合合成成时时，核核

6、苷苷酸酸是是通通过过酶酶催催化化加加到到一一个个正正在在延延伸伸的的DNA链链上上，这这种种酶酶要要求求一一条条完完整整的的DNA链链作作为为模模板板，去去合合成成一一条互补链，所以这样的酶叫做条互补链，所以这样的酶叫做DNA指导的指导的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶。ArthurKornberg（斯斯坦坦福福大大学学医医学学院院教教授授）等等人人从从1955年年开开始始寻寻找找合合成成DNA的的酶酶。于于1956年年在在大大肠肠杆杆菌菌的的提提取取液液中中发发现了现了DNA聚合酶。聚合酶。Kornberg发发现现的的DNA聚聚合合酶酶就就是是现现在在的的DNA聚聚合合酶酶I，是是分分子

7、子量量为为109,000的的一一条条多多肽肽链链，具具有有聚聚合合活活性性及及3-5外外切切酶酶活活性性，还还有有5-3核核酸酸酶酶活活性性。以以后后又又陆陆续续发发现现了了功功能能不不同同的的另另外外几几种种DNA聚聚合合酶酶，下下表表归归纳纳了了到到目目前前为为止止从从大大肠肠杆杆菌菌和和哺哺乳乳动动物中发现的物中发现的DNA聚合酶的基本特征。聚合酶的基本特征。12.3DNA聚合酶聚合酶III催化复制叉处的聚合反应催化复制叉处的聚合反应见见P414；其中；其中；Klenow片段：片段：PolIII的结构和功能，见P416聚合反应的基本过聚合反应的基本过程都是通过新合成的链程都是通过新合成的

8、链的的3-OH对进入的新的核对进入的新的核苷三磷酸（用苷三磷酸（用dNTP）的）的 磷进行亲核攻击磷进行亲核攻击磷进行亲核攻击磷进行亲核攻击，导致，导致磷酯键断裂，结果在链磷酯键断裂，结果在链的的3末端加上了一个新的末端加上了一个新的核苷酸，即延长了一个核苷酸，即延长了一个核苷酸核苷酸。释放出的焦磷酸经释放出的焦磷酸经焦磷酸酶水解有利于聚焦磷酸酶水解有利于聚合反应的进行合反应的进行双重核对功能：双重核对功能：双重核对功能：双重核对功能：DNA聚合酶的选择聚合酶的选择作用；作用；3-5外切外切酶的校对作用。酶的校对作用。右图为右图为“酶对底物的酶对底物的专一性的校正反应专一性的校正反应”。详见详

9、见P414415 由由于于DNA的的两两条条模模板板链链是是反反平平行行的的，又又因因为为DNA总总是是沿沿53方方向向合合成成，即即两两条条新新链链是是沿沿着着相相反反方方向向合合成成。换换句句话话说说，就就是是一一条条子子链链的的合合成成方方向向与与复复制制叉叉移移动动的的方方向向一一致致，该该子子子子链链链链称称称称为为为为前前前前导导导导链链链链；而而另另一一条条子子链链与与复复制制叉叉移移动动的的方方向向相相反反，这这这这条条条条链链链链称称之之为为滞滞滞滞后后后后链链链链，但但但但也也也也是是是是通通通通过过过过通通通通过过过过5533方方方方向向向向聚聚聚聚合合合合形形形形成成成

10、成的。的。的。的。12.4.1 12.4.1 12.4.1 12.4.1 在滞后链中在滞后链中在滞后链中在滞后链中DNADNADNADNA的合成是不连续的的合成是不连续的的合成是不连续的的合成是不连续的 根根根根据据据据岗岗岗岗崎崎崎崎实实实实验验验验，可可可可以以以以确确确确定定定定复复复复制制制制叉叉叉叉的的的的一一一一个个个个“杈杈杈杈”（前前前前导导导导链链链链）是是是是沿沿沿沿5 5-3 3方方方方向向向向连连连连续续续续合合合合成成成成的的的的，而而而而另另另另一一一一条条条条链链链链（滞滞滞滞后后后后链链链链）是是是是通通通通过过过过岗岗岗岗崎崎崎崎片片片片段段段段方方方方式式式

11、式不不不不连连连连续续续续合合合合成成成成的的的的。连连连连续续续续和和和和不不不不连连连连续续续续合合合合成成成成的的的的结结结结合合合合使使使使得得得得复复复复制叉整体向一个方向延伸制叉整体向一个方向延伸制叉整体向一个方向延伸制叉整体向一个方向延伸。12.4DNA聚合酶聚合酶III同时催化两条链的合成同时催化两条链的合成岗崎岗崎岗崎岗崎片段片段片段片段复制叉移动方向复制叉移动方向先导链先导链滞后链滞后链DNA聚合酶聚合酶III同时催化两条链的合成同时催化两条链的合成前导链和滞后链的合成前导链和滞后链的合成12.4.2 12.4.2 每个岗崎片段的合成开始于一个每个岗崎片段的合成开始于一个R

12、NARNA引物引物 不不连连续续合合成成解解释释了了滞滞后后链链是是怎怎样样合合成成的的，但但不不能能解解释释每每个个岗岗崎崎片片段段是是怎怎样样开开始始合合成成的的。DNA聚聚合合酶酶III不不能能从从头头开开始始进进行行聚聚合合反反应应，它它只只能能将将核核苷苷酸酸加加到到已已有有的的多多核核苷苷酸酸链链上上。所所以以为为了了合合成成滞滞后后链链，需需要要在在复复制制叉叉处处合合成成一一系系列列的的短短的的RNA引引物物。每每个个RNA引引物物都都是是与与滞滞后后链链模模板板部部分分互互补补的的，而而且且在在DNA聚聚合合酶酶III催化下从引物催化下从引物3端延伸形成岗崎片段。端延伸形成岗

13、崎片段。RNA引引物物是是通通过过引引引引发发发发酶酶酶酶合合成成的的，引引引引发发发发酶酶酶酶是是一一个个称称为为引引引引发发发发体体体体的的的的大大大大的的的的复复复复合合合合物物物物中中的的成成分分，引引发发体体还还包包括括使使DNA解解旋旋的的解解解解旋旋旋旋酶酶酶酶和和和和其其其其它它它它的的的的一一一一些些些些辅辅辅辅助助助助蛋蛋蛋蛋白白白白。引引发发酶酶每每秒秒钟钟催催化化一一个个大大约约长长10个个核核苷苷酸酸的的RNA引引物物的的合合成成。由由于于复复制制叉叉移移动动的的速速度度大大约约为为每每秒秒1000个核苷酸，所以大约每个核苷酸，所以大约每1000个核苷酸就要合成一个个

14、核苷酸就要合成一个RNA引物。引物。12.4.3DNApolI切去切去RNARNA引物，并使岗崎片段延伸引物，并使岗崎片段延伸DNApolI识识别别并并结结合合于于新新DNA链链的的3端端和和下下一一个个RNA引引物物之之间间的的切切口口。然然后后53外外切切酶酶活活性性催催化化第第1个个RNA核核苷苷酸酸水水解解，而而5533聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶活活活活性性性性将将将将一一一一个个个个脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸加加加加到到到到新新新新DNADNA链链链链的的的的33端，端，端，端，这种同时降解和合成的过程称为这种同时降解和合成的过程称为切口平移切口平移切口平移切口平移。通通

15、过过这这种种方方式式，使使得得切切口口沿沿滞滞后后链链移移动动。在在完完成成切切去去RNA引引物物和和填填充充RNA引引物物切切去去后后的的空空缺缺后后，DNApolI脱脱离离DNA，留留下下了了被被一一个个切切口口（一一个个磷磷酸酸二二酯酯键键的的空空）分分开开的的双双链链DNA。最最后后在在DNA连连接接酶酶催催化化下下，一一个个岗岗崎崎片片段段的的3末末端端和和另另一一个个岗岗崎崎片片段段的的5磷磷酸酸基基团团之之间间形形成成一一个个磷磷酸酸二二酯酯键键，完完成成了了两两个岗崎片段的合成。个岗崎片段的合成。引发体引发体引物酶引物酶DNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶IDNA连接酶连

16、接酶滞后链滞后链前导链前导链单链结合蛋白单链结合蛋白解旋酶解旋酶12.5复制叉移动需要多蛋白复合体复制叉移动需要多蛋白复合体复制叉的移动除了需要用于聚合反应的复制叉的移动除了需要用于聚合反应的DNApolIII以外，以外，至少还需要四种其它蛋白质。其中主要的蛋白是至少还需要四种其它蛋白质。其中主要的蛋白是解旋酶、拓扑异解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白和构酶、单链结合蛋白和DNA引发酶（也称为引物合成酶）引发酶（也称为引物合成酶）。解解解解旋旋旋旋酶酶酶酶：是是个个需需要要ATP的的酶酶，该该酶酶刚刚好好在在移移动动的的复复制制叉叉的的前前面面沿沿着着单单链链DNA滑滑动动。E.coli中中最最

17、重重要要的的解解旋旋酶酶是是DnaB，它它是是一一个个与与引引发发体体中中的的引引发发酶酶紧紧密密聚聚合合的的蛋蛋白白质质。DnaB使使复复制制叉叉前前面面的的双双螺螺旋旋DNA解解旋旋，解解旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。拓拓拓拓扑扑扑扑异异异异构构构构酶酶酶酶I I和和和和IIII：是是用用来来将将解解旋旋酶酶作作用用后后产产生生的的扭扭转转张张力力释释放放掉掉。DNA快快速速解解旋旋在在复复制制叉叉处处形形成成超超螺螺旋旋头头部部。拓拓扑扑异异构构酶酶I是是切切断断DNA中中的的一一条条链链，使使DNA旋旋转，而拓扑异构酶转，而拓扑异构酶II可

18、以切断可以切断DNA的两条链的两条链。单单单单链链链链结结结结合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白（SSBSSBSSBSSB）：其其其其作作用用是是当当解解旋旋酶酶作作用用后后，它它可可以以防防止止解解开开的的螺螺旋旋恢恢复复原原来来状状态态。它它对对单单链链DNA有有非非常常高高的的亲亲和和性性，在在滞滞后后链链合合成成的的开开始始需需要要单单链链结结合合蛋蛋白白，螺螺旋旋解解旋旋后后，前前导导链链可可以以连连续续合合成成时时就就不不需需要要这这种种蛋白了。蛋白了。DNADNADNADNA引引引引发发发发酶酶酶酶：这这个个酶酶沿沿着着滞滞后后链链在在有有规规则则的的间间隔隔内内合合成成短短的的RNA引引

19、物物。然然后后通通过过DNApolIII在在引引物物的的3-OH端端沿沿着着5-3方方向向合合成成岗岗崎崎片片段段。RNA引引物物可可以以被被DNApolI除除去去，然然后后用用互互补补的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸填填上上。在在复复制制起起点点处处前导链合成开始时也需要引发酶前导链合成开始时也需要引发酶。DNADNA连接酶（连接酶（19671967年发现）年发现）：若双链若双链DNADNA中一条链有切口，中一条链有切口，一端是一端是3 3-OH-OH，另一端是，另一端是5 5-磷酸基，连接酶可催化这两端形磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能

20、将两条游离的但是它不能将两条游离的DNADNA单链连接起来。单链连接起来。大肠杆菌和其它细菌的大肠杆菌和其它细菌的DNADNA连接酶要求连接酶要求NADNAD+提供能量，在高等生提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求物和噬菌体中，则要求ATPATP提供能量。提供能量。T4T4噬菌体的噬菌体的DNADNA连接酶连接酶不不仅能在模板链上连接仅能在模板链上连接DNADNA和和DNADNA链之间的切口，而且能连接无单链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链链粘性末端的平头双链DNADNA。3535OHOHP P连接酶的反应机制连接酶的反应机制：酶酶 +NAD+NAD+(ATP)(ATP)酶酶-

21、AMP+-AMP+烟酰胺单核苷酸（烟酰胺单核苷酸（PPiPPi）酶酶-AMP+P-5-AMP+P-5-DNA -DNA 酶酶 +AMP-P-5+AMP-P-5-DNA-DNADNA-3DNA-3-OH+AMP-P-5-OH+AMP-P-5-DNA DNA-3-DNA DNA-3-O-P-5-O-P-5-DNA+AMPDNA+AMPvDNADNA连接酶连接酶在在DNADNA复制、损伤修复、重组等过程复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用中起重要作用作用DNADNA复制示意图复制示意图复制示意图复制示意图复制体(replicon)在DNA复制过程中，由众多的酶和蛋白质参与DNA的复制作用。复制

22、体的基本活动包括：1）双链的解开；2）RNA引物的合成；3）DNA链的延长；4）切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片段；5）切除和修复错配碱基。E.coli中中，是是位位于于称称为为orioriC C遗遗遗遗传传传传位位位位点点点点的的的的单单单单一一一一一一一一个个个个起起起起点点点点。oriC区区含含有有两两种种重重复复类类型型的的多多个个拷拷贝贝，DnaA结结合合部部位位含含有有一一个个特特殊殊的的9碱碱基基对对重重复复序序列列（4个个拷拷贝贝），另另另另一一一一部部部部位位位位是是是是富富富富含含含含A-A-T13T13碱基对的重复区（碱基对的重复区（碱基对的重复区（碱基对的重复区（

23、3 3个拷贝）（图个拷贝）（图个拷贝）（图个拷贝）（图a a）。）。）。）。图图b给出了在给出了在oriC处复制起始模式。处复制起始模式。大约有大约有大约有大约有2020个个个个 DnaADnaA蛋蛋蛋蛋白与白与白与白与9 9碱基对重复区结合，并引起碱基对重复区结合，并引起碱基对重复区结合，并引起碱基对重复区结合，并引起DNADNA结构的变化，导致富含结构的变化，导致富含结构的变化，导致富含结构的变化，导致富含1313个个个个A-TA-T碱基对重复区内双螺旋变性。碱基对重复区内双螺旋变性。碱基对重复区内双螺旋变性。碱基对重复区内双螺旋变性。(见见见见P422P422表表表表34-4)34-4)

24、富含富含A-T重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一旦这个区接近其它旦这个区接近其它DNA复制蛋白，在解旋酶和复制蛋白，在解旋酶和SSB作用下作用下复复复复制泡沿双向延伸形成两个复制叉制泡沿双向延伸形成两个复制叉制泡沿双向延伸形成两个复制叉制泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成。然后引发酶合成RNA引物，引物，而而DNApolIII开始前导链和滞后链的合成。开始前导链和滞后链的合成。12.6细菌中的细菌中的DNA复制起始于染色体上唯一的一个部位复制起始于染色体上唯一的一个部位E.coli的的oriC结构模式：结构模式：a.OriC内富含内富含

25、A-T序列和序列和4个个9碱碱基对重复序列的分布；基对重复序列的分布；b.在在oriC处复制起始模式处复制起始模式在在ter区区内内存存在在5个个DNA序序列列（terA到到terE）。ter序序列列排排列列在在染染色色体体上上制制造造了了一一个个复复制制叉叉“陷陷陷陷井井井井”区区区区，复复制制叉叉可可以以进进入入但但不不能能出出来来。顺顺时时针针陷陷井井由由terB和和terC构构成成，反反时时针针陷陷井井由由terA、terD和和terE构成。构成。陷陷井井区区是是终终止止子子利利用用物物质质（Tus）的的结结合合部部位位。Tus可可以以和和每每一一个个ter结结合合。一一旦旦形形成成T

26、us-Tus-terter复复合合物物，就就就就可可可可以以以以通通通通过过过过阻阻阻阻止止止止解解解解旋旋旋旋酶酶酶酶解解解解旋旋旋旋DNADNA来来来来封封封封闭闭闭闭复复复复制制制制叉叉叉叉的的的的通通通通路路路路。Tus-ter复复合合物物只只捕捕获获来来自自一一个个方方向向（顺顺时时针针或或反反时时针针）的的复复制制叉叉，而而对对来来自自另另一一个个方方向向（反反时时针针或或顺时针）的复制叉不起作用。顺时针）的复制叉不起作用。终止区这样安排可确保两个从相反方向进入终止区这样安排可确保两个从相反方向进入终止区这样安排可确保两个从相反方向进入终止区这样安排可确保两个从相反方向进入tert

27、er区的复制叉总区的复制叉总区的复制叉总区的复制叉总能相遇能相遇能相遇能相遇，当一个复制叉遇到另一个复制叉时，当一个复制叉遇到另一个复制叉时，DNA复制就完成了。复制就完成了。12.7DNA复制终止于复制终止于ter区区E.Coli中的中的ter区组织区组织600kbter区含有区含有5个非对称的个非对称的ter部位，每个都可与部位，每个都可与Tus结合。结合。箭头表示为每个复制体设置的可能的终止部位箭头表示为每个复制体设置的可能的终止部位 真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多，如真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多，如E,coli基基因组是由因组是由4.6103kb组成的单一染色体，而真

28、核生物通常含有一组成的单一染色体，而真核生物通常含有一个以上的染色体，一般在个以上的染色体，一般在20至至30对染色体之间。虽然染色体数对染色体之间。虽然染色体数目的增加使得基因组更复杂，目的增加使得基因组更复杂，但所有生物中的但所有生物中的但所有生物中的但所有生物中的DNADNA复制的生物复制的生物复制的生物复制的生物化学机制基本上是类似的化学机制基本上是类似的化学机制基本上是类似的化学机制基本上是类似的。真核生物真核生物DNA复制还有以下一些特点复制还有以下一些特点:真核生物所含的真核生物所含的DNA聚合酶种类更多些。聚合酶种类更多些。真核生物复制叉处需要的辅助蛋白不同。真核生物复制叉处需

29、要的辅助蛋白不同。真核生物也象真核生物也象E.coli那样，复制是双向的。但那样，复制是双向的。但E.coli染色体含染色体含有唯一的复制起点，而真核生物染色体存在许多复制起点。有唯一的复制起点，而真核生物染色体存在许多复制起点。12.8真核生物真核生物DNA复制类似于原核生物复制类似于原核生物DNA复制复制真核生物中真核生物中DNADNA的复制特点的复制特点1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。多复制子。2、冈崎片段长约、冈崎片段长约200bp.3、真核生物、真核生物DNA复制速度比原核慢。复制速度比原核慢。4

30、、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种、真核生物有多种DNA聚合酶。聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有、真核生物线性染色体两端有端粒端粒结构，防止染色体间的末结构，防止染色体间的末端连接。由端连接。由端粒酶端粒酶负责新合成链负责新合成链5 RNA引物切除后的填引物切除后的填补，亦保持补，亦保持端粒的一定长度端粒的一定长度。滚环复制滚

31、环复制首先一个引发体组装在模板链（链）上首先一个引发体组装在模板链（链）上，开，开始合成始合成RNA引物，然后在引物，然后在DNApolIII作用下，引物作用下，引物延伸生成一个互补链（链）。延伸生成一个互补链（链）。生成的双链生成的双链DNA分子通过一个噬菌体编码的内分子通过一个噬菌体编码的内切酶在链上的特定部位制造一个缺口。切酶在链上的特定部位制造一个缺口。最后在最后在DNApolIII作用下，链从暴露出的作用下，链从暴露出的3羟基延伸，取代原来的链。羟基延伸，取代原来的链。12.9DNA复制的其它方式复制的其它方式线粒体线粒体DNA的复制采取的是一的复制采取的是一种特殊的种特殊的D-D-

32、环环环环复制方式：复制方式：环状双螺旋环状双螺旋DNA在某一点在某一点解旋，开始复制。但前导链和解旋，开始复制。但前导链和滞后链的起点不在同一位点。滞后链的起点不在同一位点。首先合成前导链，结果一条链首先合成前导链，结果一条链（滞后链模板）仍维持单链。（滞后链模板）仍维持单链。形成一个形成一个形成一个形成一个D D字型的环字型的环字型的环字型的环。当前导链。当前导链合成到某一点时，合成到某一点时，露出滞后链露出滞后链露出滞后链露出滞后链的起点的起点的起点的起点，滞后链开始复制。，滞后链开始复制。D-环复制环复制逆转录病毒的基因组是逆转录病毒的基因组是RNARNA分子分子分子分子，在感染期间，在

33、感染期间，RNA分子可以分子可以逆转录为逆转录为逆转录为逆转录为DNADNA分子分子分子分子。DNA再再转录生产转录生产病毒病毒RNA，或者与宿主，或者与宿主DNA分子整合，使病毒潜伏分子整合，使病毒潜伏于宿主后代中。于宿主后代中。将将逆逆转转录录病病毒毒RNA转转换换成成DNA的的最最关关键键酶酶是是逆逆逆逆转转转转录录录录酶酶酶酶。该该酶酶具具有有RNaseH活活性性（降降解解RNA活活性性）和和DNA聚合酶活性聚合酶活性。12.10利用利用RNA作为模板，逆转录酶可作为模板，逆转录酶可以催化以催化DNA合成合成mRNARNA-DNA杂化体杂化体单链单链DNA双链双链DNAmRNA的的cD

34、NA拷贝拷贝逆转录病毒生逆转录病毒生活循环中的活循环中的7个个主要过程主要过程 逆转录病毒逆转录病毒进入宿主细胞进入宿主细胞进入宿主细胞进入宿主细胞；在逆转录酶的催化下，以病毒的在逆转录酶的催化下，以病毒的RNARNA为模板合成为模板合成互互互互 补补补补DNADNADNADNA（cDNAcDNAcDNAcDNA），形成形成RNA-DNARNA-DNA杂化体，逆转录酶杂化体，逆转录酶 将杂化体中的将杂化体中的RNARNA降解，同时以剩下的降解，同时以剩下的DNADNA链为模链为模 板合成另一条互补的板合成另一条互补的DNADNA链，链，结果形成双链结果形成双链结果形成双链结果形成双链DNADN

35、ADNADNA；双链双链DNADNA整合到宿主整合到宿主整合到宿主整合到宿主DNADNADNADNA中；中；利用宿主复制和转录机器生产大量的利用宿主复制和转录机器生产大量的病毒病毒病毒病毒RNARNARNARNA；转录出的转录出的mRNAmRNA翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶 和壳体蛋白；和壳体蛋白；将病毒将病毒RNARNA、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒 的核壳体；的核壳体；核壳体结合包膜蛋白形成核壳体结合包膜蛋白形成完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒。逆逆转转录录酶酶没没有有35外外切切酶酶活活性性或或

36、校校正正活活性性，所所以以它它的的错错误误率率比比任任何何DNA聚聚合合酶酶都都高高，例例如如人人免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒I（HIVI）逆逆转转录录酶酶每每合合成成2000到到4000核核苷苷酸酸就就会会掺掺入入一一个个不不正正确确的的碱碱基基，这这也也部部分说明了分说明了HIVI的高突变率。的高突变率。12.11损伤的损伤的DNA可以修复可以修复1、脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成、脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成DNA损伤损伤DNA损损伤伤常常见见形形式式是是通通过过N-糖糖苷苷键键的的水水解解，鸟鸟嘌嘌呤呤或或腺腺嘌嘌呤呤的的自自发发脱脱嘌嘌呤呤作作用用形形成成脱脱氧

37、氧核核糖糖。据据估估计计人人体体内内细细胞胞中中每每天天每每109碱碱基基对对就就有有多多达达103碱碱基基对对发发生生脱脱嘌嘌呤呤。另另一一种种类类型型损损伤伤是是胞胞胞胞嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶脱脱脱脱氨氨氨氨形形形形成成成成尿尿尿尿嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶，如如果果不不能能校校正正，在在DNA复复制制后后，一个一个C-G碱基对就将变成一个碱基对就将变成一个A-T碱基对了。碱基对了。化化学学因因素素：如如亚亚硝硝酸酸与与亚亚硝硝酸酸盐盐，可可加加速速C C脱氨基生成脱氨基生成U U，A A脱氨基生成脱氨基生成I I。胞胞嘧嘧啶啶脱脱氨氨如如不不校校正将导致：正将导致：G-C突变为突变为A-TCUU A紫紫

38、外外线线和和离离子子辐辐射射诱诱导导有有可可能能形形成成胸胸胸胸腺腺腺腺嘧嘧嘧嘧啶啶啶啶二二二二聚聚聚聚体体体体。一一个个胸胸腺腺嘧嘧啶啶的的C-5、C-6与与相相邻邻胸胸腺腺嘧嘧啶啶上上同同样样位位置置的的碳碳之之间间形形成成一一个个环环环环丁丁丁丁基基基基环环环环，结结果果使使得得DNA骨骨架架的的结结构构发发生生了了改改变变，有有可可能能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。胸腺嘧啶形成的示意图胸腺嘧啶形成的示意图2在在E.coli中存在中存在5种基本的修复系统种基本的修复系统 E.coli中中存存在在的的5种种基基本本类类型型的

39、的DNA修修复复系系统统：直直接接修修复复，(核苷酸与碱基核苷酸与碱基)切除修复、错配修复、重组修复和切除修复、错配修复、重组修复和SOS修复。修复。A.A.A.A.直接修复直接修复直接修复直接修复 某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复。他们不切断复。他们不切断DNA或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤修复机制称为修复机制称为直接修复直接修复。DNA损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的，胸腺

40、嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的，光激活酶光激活酶光激活酶光激活酶可以结合胸腺嘧可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下，啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下，光激活光激活光激活光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-TA-T碱基对重新形成，碱基对重新形成，碱基对重新形成，碱基对重新形成，然然后光复活酶从已修复好的后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。上脱落。通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程B.B.核苷酸切除修复核苷酸切除

41、修复 修复酶是由基因修复酶是由基因uvrA、uvrB和和uvrC分别编码的三分别编码的三个亚基组成的，所以该酶个亚基组成的，所以该酶又称为又称为ABCABC切除核酸酶切除核酸酶切除核酸酶切除核酸酶。首先首先首先首先ABCABC切除核酸酶切除核酸酶切除核酸酶切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含从损伤部位的两侧切去含从损伤部位的两侧切去含从损伤部位的两侧切去含有损伤的有损伤的有损伤的有损伤的DNADNA链，链，链，链，结果都结果都出现一个单链缺口。然后出现一个单链缺口。然后在在DNA聚合酶催化下按照聚合酶催化下按照互补链填充缺口，切口最互补链填充缺口，切口最后通过后通过DNA连接酶连接。连接酶连接。C

42、.C.碱基切除修复碱基切除修复 DNADNA糖基化酶糖基化酶糖基化酶糖基化酶是一个能识别是一个能识别DNA中象尿嘧啶、次黄嘌呤中象尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶，这些碱基都是由胞嘧啶、和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶，这些碱基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断糖基化酶切断N-糖苷键除去，这样一来在糖苷键除去，这样一来在DNA中制造了中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之AP位点。位点。每种每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤

43、特异。例糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如如尿嘧啶糖基化酶尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，形成一个形成一个AP位点。然后一个称为位点。然后一个称为AP内切核酸酶内切核酸酶切去含有切去含有AP位点的脱氧核糖位点的脱氧核糖-5-磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连连接酶将切口封闭。接酶将切口封闭。尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程D.D.错配修复错配修复 偶偶尔尔错错误误的的DN

44、A复复制制会会导导致致新新合合成成的的链链与与模模板板链链之之间间的的一一个个错错误误的的碱碱基基配配对对。这这样样的的错错误误可可以以通通过过E.coli中中的的3个个蛋蛋白白质质（MutSMutS、MutHMutH和和和和MutLMutL）校校正正。该该修修复复系系统统只只能能校校正正新新合合成成的的DNA，其其主主要要依依据据是是新新合合成成的的链链中中GATC序序列列中中的的A（腺腺苷苷酸酸残残基基）开开始始未未被被甲甲基基化化。GATC中中A甲甲基基化化与与否否常常用用来来区区别别新新合合成成的的链链（未未甲甲基基化化）和和模模板板链链（甲甲基基化化）。这这一一区区别别很很重重要要，

45、因因为为修修复复酶酶需需要要识识别别两两个个核核苷苷酸酸残残基基中中的的哪哪一一个个是是错错配配的的，否否则则如如果果将将正正确确的的核核苷苷酸酸除除去去就就会会导导致致突突变变。未未甲甲基基化化的的GATC序序列列不不需需要要紧紧靠靠着着错错配配碱碱基基，因因为为错错配配碱碱基基与与GATC序序列列之之间间的的间间隔隔的的DNA序序列列可可以以被被外外切切核核酸酸酶酶切切除除，是是从从3还还是是从从5方向切除取决于不正确碱基的相对位置。方向切除取决于不正确碱基的相对位置。错配修复错配修复E.DNAE.DNA的重组修复的重组修复胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体二聚体复制复制核酸酶及核酸酶及重组蛋白重组蛋

46、白修复复制修复复制DNA聚合酶聚合酶DNA连接酶连接酶重组重组重组修复重组修复(recombination(recombination repairing)repairing)：这这是是DNADNA的的复复制制过过程程中中所所采采用用的的一一种种有有差差错错的的修修复复方式。方式。F.SOSF.SOS修复：修复：这这是是一一种种在在DNADNA分分子子受受到到较较大大范范围围损损伤伤并并且且使使复复制制受受到到抑抑制制时时出出现现的的修修复复机机制制，以以SOSSOS借喻细胞处于危急状态。借喻细胞处于危急状态。DNADNA分分子子受受到到长长片片段段高高密密度度损损伤伤，使使DNADNA复制过

47、程在损伤部位受到抑制。复制过程在损伤部位受到抑制。损损伤伤诱诱导导一一种种特特异异性性较较低低的的新新的的DNADNA聚聚合合酶，以及重组酶等的产生。酶，以及重组酶等的产生。由由这这些些特特异异性性较较低低的的酶酶继继续续催催化化损损伤伤部部位位DNADNA的的复复制制，复复制制完完成成后后，保保留留许许多多错错误的碱基，从而造成突变。误的碱基，从而造成突变。SOS反应的机制反应的机制未诱导的细胞未诱导的细胞靶基因靶基因lexA基因被基因被LexA蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏recA基因被基因被LexA蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物阻

48、遏物)RecA(辅蛋白酶辅蛋白酶)靶基因表达靶基因表达lexA靶基因表达靶基因表达但产物被分解但产物被分解recA大量表达大量表达RecA促使促使分解分解LexA诱导的细胞诱导的细胞单链单链DNAATP第三节第三节DNA的突变的突变DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为称为DNADNA的突变的突变的突变的突变。它包括由于。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，损伤和错配得不到修复

49、而引起的突变，以及由于不同以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。分子之间的交换而引起的遗传重组。二、二、诱变剂的作用诱变剂的作用(自修自修)碱基类似物碱基类似物(baseanalog)碱基修饰剂碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料嵌入染料(intercalationdye)紫外线紫外线(ultraviolet)和电离辐射和电离辐射(ionizingradiation)一、一、突变的类型突变的类型 碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(framesshiftmutation)要点归纳要点归纳 1.DNADNA复复制制是是半半保保留留复复制制，

50、半半保保留留复复制制已已经经经经Meselson-Meselson-StahlStahl实实验验证证实实。在在半半保保留留复复制制方方式式中中两两条条亲亲代代链链分分开开，分分开开后后的的每每一一条条链链都都可可作作为为模模板板用用于于合合成成互互补补的的、反反平平行行的的子子链链。就就是是说说双双螺螺旋旋子子链链中中有有一一条条链链来来自自亲亲代代链链，另另一一条条链则是以该亲代链为模板新合成的互补链。链则是以该亲代链为模板新合成的互补链。2.DNA合成需要合成需要DNA聚合酶，聚合酶，DNA聚合酶需要一个聚合酶需要一个游离的游离的3羟基作为引物（可以由羟基作为引物（可以由RNA或或DNA提

51、供），以脱提供），以脱氧核苷三磷酸作为底物，催化氧核苷三磷酸作为底物，催化 3羟基与脱氧核苷三磷酸的羟基与脱氧核苷三磷酸的5-磷酸基团形成磷酸二酯键，释放出焦磷酸（随后水解磷酸基团形成磷酸二酯键，释放出焦磷酸（随后水解为无机磷酸），使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸链中。新为无机磷酸），使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸链中。新链按链按53方向生长。方向生长。3.原原核核生生物物中中存存在在3 3种种聚聚合合酶酶（pol pol I I、IIII和和IIIIII）。而而真真核核生生物物中中存存在在5 5种种聚聚合合酶酶（polpol、和和）。在在E.coliE.coli中中，pol pol 是是主主要要的

52、的复复制制酶酶，而而pol pol I I既既有有复复制制功功能能，又又有有修修复复功功能能。所所有有三三种种原原核核生生物物的的DNADNA聚聚合合酶酶都都具具有有3535外外切切酶酶的的活活性性，该该酶酶可可以以将将经经聚聚合合酶酶催催化化错错配配的的核苷酸切去。核苷酸切去。DNA pol IDNA pol I和和IIIIII还具有还具有5353外切酶活性。外切酶活性。4.复制起始发生在复制起点，复制起始发生在复制起点，E.coli中存在唯一的复中存在唯一的复制起点（制起点（OriC），从一个复制起点沿着相反方向双向进行。），从一个复制起点沿着相反方向双向进行。真核生物染色体含有许多复制起

53、点。真核生物真核生物染色体含有许多复制起点。真核生物DNA的复制的复制也是双向进行的，但与也是双向进行的，但与E.coli不同，可以在许多复制起点同不同，可以在许多复制起点同时双向进行复制。时双向进行复制。5.DNADNA复复制制需需要要双双链链解解旋旋形形成成复复制制叉叉，解解旋旋需需要要解解旋旋酶酶，ATPATP驱驱动动的的解解旋旋酶酶使使复复制制起起点点（OriCOriC）区区解解旋旋，制制造造复复制制叉叉，单单链链结结合合蛋蛋白白与与两两条条模模板板链链结结合合防防止止他他们们重重新新形形成成双双螺螺旋旋。在复制叉处，亲代在复制叉处，亲代DNADNA的两条链作为模板用于合成新的的两条链

54、作为模板用于合成新的DNADNA。6.由于由于DNA聚合酶催化的链的延伸是聚合酶催化的链的延伸是53方向，以及方向，以及双螺旋双螺旋DNA中的两条链是反平行的，因此聚合酶沿着复制中的两条链是反平行的，因此聚合酶沿着复制叉处两条模板链移动的方向是相反的。结果造成一条链叉处两条模板链移动的方向是相反的。结果造成一条链（前导链）的合成是连续的，合成方向与复制叉移动方向（前导链）的合成是连续的，合成方向与复制叉移动方向一致；另一条链（滞后链）的合成是不连续的，合成方向一致；另一条链（滞后链）的合成是不连续的，合成方向与复制叉移动方向相反。与复制叉移动方向相反。7.复复制制起起始始是是借借助助于于引引发

55、发酶酶合合成成的的RNARNA引引物物开开始始的的，前前导导链链合合成成需需要要一一个个RNARNA引引物物，而而滞滞后后链链需需要要多多个个RNARNA引引物物。在在滞滞后后链链合合成成中中，在在DNA DNA pol pol IIIIII催催化化下下，由由每每个个引引物物按按照照模模板板链链合合成成互互补补短短DNADNA片片段段，称称之之为为岗岗崎崎片片段段。然然后后DNA DNA pol pol 的的5353外外切切酶酶活活性性将将 RNA RNA 引引物物切切除除，再再通通过过其其聚聚合合酶酶活活性性催催化化冈冈崎崎片片段段之之间间空空隙隙的的核核苷苷酸酸填填充充，最最后后DNADNA连连接接酶酶将将新新生生的冈崎片段连接起来。的冈崎片段连接起来。8.复制的忠实性非常高，主要是由于复制的忠实性非常高，主要是由于DNA聚合酶具有聚合酶具有35外切酶的活性。但在复制过程中由于碱基配对错误、以外切酶的活性。但在复制过程中由于碱基配对错误、以及碱基共价修饰、碱基缺失和插入都会产生突变，并造成及碱基共价修饰、碱基缺失和插入都会产生突变，并造成DNA损伤。复制后的修复主要包括损伤。复制后的修复主要包括5种修复机制：直接修复、种修复机制：直接修复、切除修复、错配修复等。切除修复、错配修复等。