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1、RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达 构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencerHER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。RTPCR分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖
2、。结论构建的pSilencerHER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。RNA干扰 受体 表皮生长因子 乳腺肿瘤 瘤细胞 培养的 基因表达表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切1,是极具发展前途的基因治疗靶位。约有30乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达2,HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链RNA(doublestranded RNA,dsRNA)导入细胞后,在Di
3、cer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象3。笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。1.1.2主要试剂MMuLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒pSilencerTM3.1H1 ne
4、o(美国Ambion公司);限制性内切酶BamH、Hind和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国RD公司);TMB Western Blot试剂盒(美国KPL公司)。图1pSilencer质粒图谱Fig 1pSilencer plasmid map1.2方法1.2.1构建短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒根据GenBank数据库提供的HER2基因序列(NM004448),按照siR
5、NA的设计原则,利用Ambion公司在线设计软件设计siRNA序列,筛选出1个19核苷酸的靶序列,用siRNA Hairpin寡核苷酸序列设计软件设计成双链发夹结构,双链的5端引入BamH位点,3端引入Hind位点,中间9个核苷酸是用于形成发夹结构,在3端有一个TTTTTT的终止信号。DNA正义链：5GATCCGGACATCTTCCACAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTGTGGAAGATGTCCTTTTTTGGAAA3DNA反义链：3GCCTGTAGAAGGTGTTCTTGAAGTTCTCTCAAGAACACCTTCTACAGGAAAAAACCTTTTCGA5由大连宝生物工程公司合成,
6、2条DNA链退火形成双链DNA,与线性化载体在16 连接过夜,无义对照质粒由美国Ambion公司提供,转化感受态大肠杆菌。随机挑选转化菌落,小量提取质粒,进行酶切鉴定,鉴定正确的shRNA重组质粒(pSilencerHER2)进行测序。1.2.2细胞培养人乳腺癌细胞SKBr3,用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,于37 、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养和传代。1.2.3细胞转染转染前1 d,将SKBr3细胞接种6孔板,每孔3105,3 mL,置37 、体积分数为0.05的CO2培养箱培养过夜,待细胞生长融合达85%90%后,采用siPORT XP1试剂(美国Ambion公
7、司)按说明书方法进行转染,每孔加入脂质体2.0 L和重组质粒pSilencerHER2 1.0 g,同时转染无义质粒(pSilencerneospecial)作为对照。转染48 h后检测目的基因的表达。1.2.4RTPCR检测HER2基因表达用Trizol按说明书方法抽提转染48 h后细胞总RNA,用紫外分光光度计定量,经MMlv酶反转录为cDNA。采用Primer premier 6.0软件设计引物,HER2引物：上游:5CCATCAAAGTGTTGAGGGAAAAC3下游:5AATCTGCATACACCAGTTCAGCA3PCR产物778 bp,内参照GAPDH引物：上游:5GGTGAAG
8、GTCGGAGTCAACG3下游:5CAAAGTTGTCATGGATGACC3PCR产物500 bp,PCR反应体系总体积为50 L,内含模板cDNA 100 ng,引物1.0 mol/L,dNTP 0.2 mol/L,MgCl22.0 mol/L和TaqDNA聚合酶2.5 U。PCR反应条件为:94 变性5 min进入循环,94 60 s59 60 s72 60 s,经30个循环扩增后72 延伸10 min。取PCR产物10 L用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,凝胶自动成像仪直接观察,并行光密度扫描和图像分析,以HER2/GAPDH的光密度比值表示相对表达水平。1.2.5Western blot
9、检测细胞HER2蛋白表达水平按试剂盒说明书方法操作。将转染48 h后的pSilencerHER2重组质粒组、无义质粒组及未转染组细胞分别用PBS洗3次,以低渗缓冲液(50 mmol/L TrisCl,0.2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L PMSF,0.1 mmol/L DTT,pH 7.5)裂解细胞,制备细胞总蛋白,取蛋白100 g上样进行不连续SDSPAGE电泳,浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%。电转移到硝酸纤维素膜后,封闭液过夜,然后与鼠抗人HER2单克隆抗体孵育1 h,再与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h,用TMB显色,拍照。1.2.6细胞增殖试验实验分为3组,包括pSilencerHER2重组质粒组、无义质粒组及未转染组。转染前1 d,细胞以1104 mL1浓度接种96孔培养板中,每孔200 L,每组设3个复孔,置37 、体积分数为0.05的CO2培养箱培养,每孔以脂质体0.12 L和重组质粒40 ng进行转染。在转染后16 d,每天在同一时间点各取出3个孔进行试验,每孔加入MTT工作液20 L,37 反应4 h,弃去MTT反应液,加入二甲亚砜200 L,室温振荡10 min,用酶标仪测定D(570 nm)值,绘制细胞生长曲线。1.3统计学处理采用SPSS 10.0软件对数据进行非配对t检验。
RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达
