丹参酮IIA磺酸钠稳定性试验

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1、第六章 丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及稳定性分析6.1丹参酮IIA磺酸钠相关杂质及结构鉴定丹参酮IIA磺酸钠原料在生产和储存过程中都会出现稳定性问题，如酸性增 强、含量降低等现象，质量标准中监控其相关物质成为必要，提供高纯度的相关 物质对照品成为很大挑战。随着药品质量标准提高，ICH要求尽可能提供单杂大 于0.1%的相关物质结构和可能的产生机制，构效关系和药理毒数据等。因此我 们从丹参酮IIA磺酸钠原料生产过程中的精制母液中分离纯化获得相关物质，并 和丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质进行HPLC对照，再通过LC-MS和1H-NMR 分析，最终确定其结构。Baolin Wang等从丹参酮IIA磺

2、酸钠原料中通过色谱分离纯化、LC-MSn和NMR 鉴定推测出八种相关物质；Qiaogen Zou等从丹参酮IIA磺酸钠 原料中通过色 谱分离纯化、UV、LC-MS和NMR鉴定推测出六种相关物质。而其磺化过程中的副 产物和杂质成分研究还不够完善，我们通过制备液相技术分离纯化丹参酮IIA 磺酸钠精制母液中的组分，寻找确定丹参酮IIA磺酸钠原料中的相关物质，通过 分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，分别确证为丹参酮IIB磺酸钠（2）、 丹参酮I磺酸钠（4）紫丹参甲素磺酸钠（5/6）,其中4已作为药典标准中的杂 质对照品（中国药典2000年版二部附录VB），但2和5/6尚未见有文献报道得 到纯物质

3、。126.1.1仪器与原料Varian SD-1液相制备及色谱装填系统，色谱柱L&L4001,1 inch. X25cm， 色谱柱4002 ,2inch, X25cm；孔径12nm粒径5p m色谱填料0DS-AQ100g，理论 工作压力1500psi, YMC;孔径12nm粒径10m色谱填料PLRP-S150g，理论工作 压力 650psi， Angilent Technologies； Waters2695/2489 高效液相色谱仪；色 谱柱 Angilen t Ext end C18 5p m，4.6X 15cm； 400M 核磁共振波谱仪，NMR Avance III 400MHz，瑞士

4、公司；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪，ACQUITYtimUPLC&Q-T0F MS Premier，USA Waters 公司。丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液（自制）；纯化水；甲醇，HPLC,Tedia、Fisher Scientific 和 Merk； 三乙胺（TEA）,HPLC,Tedia。6.1.2方法丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液进行相关物质富集前先在37C条件下减压 旋蒸结晶后滤纸过滤在经过0.22m有机相微孔滤膜做过滤除菌处理。6.1.2.2富集和进一步纯化选用装填PLRP-S聚合物填料的Varian L&L4002色谱柱。实验体系为甲醇/ 水，20%80%梯度洗脱，流

5、速为100mL/min，检测波长为271nm。根据紫外检测 结果实时收集样品。6.1.2.3二步纯化及精制选用装填ODS-AQ硅胶填料的VarianL&L4002色谱柱。实验体系为0.1%TEA- 甲醇/0.1%TEA-水，20%60%梯度洗脱，流速为25mL/min，检测波长为271nm。 根据紫外检测结果实时收集样品。6.1.2.4 HPLC 检测在富集、纯化精制过程中采用HPLC方法对样品组成及含量进行全程监测。 HPLC 监测体系为：Agilen t Ext end C18， 5p m， 4.6 *150mm，流速为 ImL/min，检 测波长为271nm。6.1.2.5 冻干经HPL

6、C检测纯度98%的样品进行冻干保存。6.1.2.6结构鉴定将完成冻干的样品，进行LC-MS和1H-NMR检测。6.1.3结果与讨论6.1.3.1丹参酮IIA磺酸钠原料与精致母液的相关物质组成图1丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测图谱丹参酮IIA磺酸钠原料HPLC检测结果见图1。根据图中结果显示，丹参酮IIA磺酸钠原料中含有5%左右的总杂含量，主要包含了六中相关物质(编号 1,2,3,4,5,6),其保留时间分别为 13.122min，13.474min，15.576min， 17.139min，19.196min及19.433min。其中，4为已确认的丹参酮I磺酸钠，并 作为药典标准中的相关物

7、质对照品(中国药典2000年版二部附录VB)，而其余 相关物质药典中尚未提供相对关照品。为简化相关物质的富集工作，采取从车间精制母液中富集提取相关物质的方 法。丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测结果见图2。图中结果显示，精 制母液中含有保留时间为13.495min (a)和19.122 (b)的相关物质，其含量分 别为15.6%和32.6%，远高于原料中相关物质含量。S弗密图2丹参酮IIA磺酸钠车间精制母液HPLC检测图谱6.1.3.2相关物质的富集与一步纯化根据图3结果显示，利用L&L4002柱进行一次富集后，可获得HPLC纯度达 到40%50%的相关物质样品。3.3-1綾鶴瞬緞图3

8、富集后相关物质a (3.3-1) 和 b (3.3-2)的HPLC检测图步纯化体系同富集体系，梯度洗脱20%60%。根据图4结果显示，经过步纯化后，相关物质a、b纯度已达到80%。图4 一步纯化后相关物质a （3.4-1） 和 b （3.4-2） 的 HPLC检测图豎SX舊.4 舊6.1.3.3二部纯化及精制相关物质的二步纯化及精制过程选用装填 ODS-AQ硅胶填料的Varian L&L4001色谱柱。实验体系为0.1%TEA-水。根据图5的结果可见，经过二步纯化 和精制两步骤，获得纯度98%的a和b。样品加入丹参酮IIA磺酸钠原料，根据 HPLC结果推出a可能为相关物质2, b可能为相关物质

9、5和6。图5二步纯化和精制后相关物质a（3.5-1）和 b（3.5-2）的 HPLC检测图6.1.3.4结构鉴定与解析相关物质2为无定形红棕色粉末，如图6所示，LC-MS测得其分子离子峰C H OS（M-Na-）质荷比（m/z）为389.0.1H-NMR （D0,400MHz，ppm）数据（见191772图7）显示，两个甲基氢化学位移信号5 7.530 （1H，J=8.0H，d，H-6）和8 7.181HZH（1H，J=8.0H d，H-7）；三个亚甲基氢化学位移信号5 2.680-2.730（2H，m，Z，H-1），5 1.401-1.083（2H，m，H-19），化学位移受离子对试剂TEA

10、残留干扰，H最终确定其结构如图8所示，为丹参酮IIB磺酸钠。LW2D130106 1NEG1:TOFM$eS*TIC2.0966,， I | | Time2.00aoo4D05.00FMMMO10.0011.00图6丹参酮IIA磺酸钠相关物质2 LC-MS数据a _ pt图7丹参酮IIA磺酸钠相关物质21H-NMR数据相关物质4为无定形褐色粉末，其在HPLC检测体系中保留时间为17.1min。MS测得其分子离子峰C H OS（M-Na-）质荷比（m/z）为355.0265,根据iH-NMR18 11 6（D C0D,400MHz, ppm）数据显示，两个甲基氢化学位移信号8 2.49（3H,

11、s, H-19）, 3五个苯氢化H学位移信号 8 9.260（ 1H，J =8.8Hz，d，H-1），HH-2），8 7.406（1H，J =6.8Hz，d，H-3）, 8 8.478HHd，H-6），8 8.004（1H，J =8.8Hz，d，H-7）。相关物质 4 目前H尚在研究中，推测其为丹参酮I磺酸钠，结构结构如图8所示。8 7.532-7.572H(1H,J =8.8Hz,(1H, m，相关物质5/6为无定形红棕色粉末，LC-MS测得其分子离子峰C H OS19177（M-Na-）质荷比（m/z）为 389.0H-NMR（D 0,400 MHz，ppm）数据显示，两个2苯氢化学位移信

12、号6 4.789（2H，m，H-2）和5 1.530-1.635（2H，m，H-3）； -CH OHHH2氢化学位移信号5 4.789（2H，s，H-17），化学位移受离子对试剂TEA残留干扰。H目前推测其为紫丹参甲素磺酸钠，结构结构如图8所示。C110STSHSO3Na相关物质2相关物质5/6SO3Na12 131/SO3Na相关物质4图8推测丹参酮IIA磺酸钠相关物质化学结构表1丹参酮IIA磺酸钠相关物质HPLC检测及MS数据相关物质t (min)RM-Na- (m/z)化学结构213.19389丹参酮IIB磺酸钠417.02355丹参酮I磺酸钠（推测）5/619.14389紫丹参甲素磺酸

13、钠（推测）丹参酮IIA磺酸钠21.2373丹参酮IIA磺酸钠综上，通过分子量和氢谱数据鉴定出三种相关物质结构，其中相关物质2 确证为丹参酮IIB磺酸钠（Sodium Tanshinone IIB Sulfonate），相关物质4 和相关物质5/6还有待进一步研究确认，目前推测其分别为丹参酮I磺酸 钠 （Sodium Tanshinone I Sulfonate，4）和紫丹参甲素磺酸钠（SodiumTanshinone I Sulfonate, 5/6）。其中2的标准纯物质尚未被报道过，见表1。丹参酮IIA磺酸钠相关物质产生主要来源于丹参酮IIA原料中丹参组织来源 的丹参酮IIA结构类似物引入合

14、成工艺中磺化反应过程，产生副反应产物，在精 制过程重结晶时的共结晶沉淀，以及丹参酮IIA磺酸钠原料制备和保存过程中的 降解反应等。相关物质4、5/6目前限于LC上难以区分，其准确定位有待进一步 研究。& 2丹参酮IIA磺酸钠稳定性分析丹参酮IIA磺酸钠是从中药丹参中提取丹参酮IIA,经磺化后得到的水溶性 钠盐。由于用来制备丹参酮IIA磺酸钠的原料丹参酮IIA,是经过药材提取纯化 所得，因此不可避免的含有其它丹参酮类化合物，同时，磺化过程中也会产生很 多副产物，反应产物经过结晶后，除去了其中大部分的杂质，但仍有微量杂质存 在。而目前，丹参酮IIA磺酸钠研究主要还是集中在其药理活性的探讨上，原料

15、药中的微量杂质成分的研究还是空白。基于此方面的考虑，我们准备进行初步的 研究。国家标准记载丹参酮IIA磺酸钠（见国家药品标准WS-10001- （HD-0923） -2002）的性状为：本品为砖红色结晶性粉末；无臭，味微苦；有吸湿性；遇咼 热，见光色渐变深。在热水中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在氯仿中不溶。从上 面的叙述中我们可以知道，丹参酮IIA磺酸钠对光和热不稳定，不利于长时间加 热和光照，且具有吸湿性。稳定性试验的目的是考察原料在温度，湿度，光线的 影响下随时间变化的规律。根据丹参酮IIA的特点和我公司的实际情况，我们将 温度作为重点考察因素作一系列的试验。样品选择：抽取6批丹参酮IIA磺

16、酸钠作为供试品，批号分别为：1207154, 1207156， 1208168， 1208170， 1208171， 1208174。储存条件：以上每批样品分为5份，分别放置于0-10C,室温，30C, 40C, 50C环境中保存，定期抽样检测。抽样频率：试验起始之日起，每月取样一次，持续半年，共计7次。检测项目：含量测定和相关物质检测。丹参酮IIA磺酸钠稳定性数据见表6.1。为了更清晰直观的进行观察分析，将试 验数据转化为图表形式表现，见图6.2。根据图6.2结果显示，环境温度越高， 丹参酮IIA磺酸钠的杂质含量也越高。在高温环境中（30度、40度、50度）， 杂质含量随着储存时间增长而增大

17、。而在0-10度环境和常温下，杂质含量趋于 平稳。由此可以证明，丹参酮IIA磺酸钠对高温不稳定。1207156L里含质杂12071541 234560T0 度 亠30度 *40度 50度 室温8 6 4 2 0 L里含质杂时间（月）1207168L里含质杂1208170123456时间（月）1208171L里含质杂12081741 23456+ 0T0 度 亠30度 *40度 50度*室温2 0 8 6 4 2 0 L里含质杂时间（月）1 Baolin Wang et al.Isola tion and st rue ture charac teriza tion of rela ted im

18、purities in Sodium Tanshinone IIA Sulfonate by LC/ESI-MSn and NMR.JournalOf Pharmace uti cal and Biomedical Analysis.2012,67(68):36-41.2 Qiaogen Zou et al.Identification,isolation and characterization of impurities in sodium tanshinone IIA Sulfonate J.Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.2009,32(16):2346-2360.