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1、探究墨角藻对雌性SD大鼠和人卵巢黄素化颗粒细胞内分泌激素的影响摘要：流行病学研究报告表明：典型的亚洲膳食人群跟西方膳食人群相比有较低的激素依赖性癌症发病率这些膳食上的差别使得亚洲人摄取了更多的大豆。然而我们实验室的研究结果表明：海带的抗雌激素作用可能同样有利于减少癌症的发病率。以下针对绝经前女性做的海带摄入量跟内分泌调节之间的相关关系实验，我们研究了海带（墨角藻）对雌性大鼠和人卵巢黄素化颗粒细胞(hLGC)的内分泌调节作用。海带会影响大鼠的发情周期：175mgkg-1wtd-1(P=0.05)4.30.96d5.41.7d；350mgkg-1wtd-1(P=0.002)5.91.9d,并且10
2、0%延长了大鼠的发情周期(P=0.02)。按照175mgkg-1wtd-1的剂量喂养大鼠两周，17-雌二醇水平从48.94.5下降到40.23.2ng/L(P=0.13).四周后，17-雌二醇水平下降到36.72.2ng/L(P=0.02)。卵巢黄素化颗粒细胞,23,50以及75mol/L剂量分别使17-雌二醇水平从4732591下降到3632758,3313373，3060538ng/L。海带摄入量同样能提升卵巢黄素化颗粒细胞培育孕激素的水平。海带提取物的IC值分别为42.4,31.8和40.7时能抑制雌激素和雌激素受体和，孕激素和孕激素受体之间的结合。这些数据表明海带的内分泌调剂作用根基量
3、有关，并且表明膳食中含较多海带是日本地区激素依赖性疾病发病率如此之少的原因。关键字：墨角藻；大鼠；海带；乳腺癌；内分泌美国的激素依赖性癌症发病率逐年上涨，我们在预防这些癌症上取得的微不足道的成果都让我们对日本的膳食越来越感兴趣，因为日本是世界上乳腺癌、子宫癌、卵巢癌发病率最低的国家之一。研究调查结果显示，日本女性跟一同参加测试的西方女性相比，有较长的生理周期和较低的血清雌二醇水平，这些都可能是她们面临较低的激素依赖性癌症威胁的原因。到目前为止，亚洲人群中部分天生偏向选择富含大豆膳食有利于降低这些癌症的发病率。然而，Teas等人之前的假设是另一个有利因素可能是他们较高的海带摄入量。在人体实验中，
4、我们研究了墨角藻摄入量显著增加了生理周期的天数，减少了循环中的17-雌二醇水平，并且提升绝经前有异常生理周期史的女性的血清孕酮水平。现阶段的研究中，我们深入研究了在大鼠和人体内墨角藻调节内分泌激素对性激素和循环系统的作用。之前有研究表明，生理周期长度跟乳腺癌、子宫癌、卵巢癌之间有反相关关系。生理周期长度，月经初潮时的年龄以及孕激素都可以作为反映内源性雌二醇和更年期年龄的指标。生理周期较短的女性跟生理周期较长的女性相比吗，在她们的整个生殖周期中会有较多的月经次数。因此，那些女性就会在生殖周期中花费更多的时间在产生卵泡和黄体阶段，这个阶段中雌激素和孕激素水平，子宫内膜和乳腺细胞都是处在最高的增殖率
5、。也曾有报道指出，乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肥胖、酒精摄入量这些因素跟持续刺激雌激素以及性激素失衡之间都有正相关关系。那些实验研究表明，暴露的雌激素，雌激素和孕酮的的比例失衡可能是雌激素依赖型疾病最至关重要的影响因素。在预防一些雌激素依赖性疾病的治疗过程，还有高危个体的防御措施中，现阶段主要的策略就是阻止雌激素通过雌激素受体或者封锁芳香化酶。进一步的措施是，识别发挥化学保护作用抑制内源性雌激素产生的膳食成分，这也许可能降低乳腺癌、子宫癌、卵巢癌额发病率。利用大鼠和人体原发性卵巢黄素化颗粒细胞检测化学性内分泌干扰物用来降低癌症威胁。以雌性SD大鼠为实验对象来研究内分泌调节对乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜
6、癌作为模板参考。因为人和大鼠的卵巢分泌荷尔蒙具有相似性，所以一般用大鼠模型测试化学性内分泌干扰物。大鼠的发情期和人的生理周期中，雌二醇水平在发情期前和产卵期时达到峰值，孕激素水平在发情期和产黄体期时达到峰值。人体原发性卵巢黄素化颗粒细胞显著的刺激了黄体的产生，因为它们支持及时的在循环中动态选择雌二醇和孕激素，在生理周期中的黄体期模拟血清激素水平。卵巢黄素化颗粒细胞培养成功应用到研究化学性内分泌干扰物，比如说二噁英对卵巢雌激素和孕激素合成的作用。我们本次实验的目的就是建立起我们之前研究的实验模型：1)检测膳食中控制墨角藻的摄入量是否会扰乱SD大鼠正常的发情周期和性激素的分泌2)利用墨角藻的提取物
7、培养人体原发性卵巢黄素化颗粒细胞以研究颗粒细胞中的激素反映。为了进一步深入研究墨角藻提取物对对雌激素和孕激素的反映，我们评价它的结合雌激素受体、，孕激素受体亲和力，以及它在培养人体原发性卵巢黄素化颗粒细胞中潜在的阻止芳香化酶活力的作用。材料和方法大鼠及其发情周期的检测24只重量200-250g的成年雌性SD大鼠，安置它们独自在铁丝笼中。它们被允许自由采用实验室标准的膳食和水。经过2周简短的调整期，老鼠经过每天的阴道细胞学检测以用分期标准确定正常的发情周期。老师在实验前必须确保至少有两次连续的发情周期。一个正常的发情周期被确定为35天。一个完整的发情周期被认为是第一次发情到第二次发情之间的间隔。
8、在试验期间每周检测一次老鼠的重量。墨角藻的来源和剂量来自缅因州海岸的海水蔬菜市场的墨角藻干燥后，研磨成粉末状。海带是去年夏天从缅因湾、新不伦瑞克、新斯科舍收割来的。加工过程需要太阳晒干除根部以外的整个植体。干燥的海带之后经轧机制成粉末。剂量水平的有效范围是根据之前的人类研究报告和传统的亚洲人膳食决定的，考虑到老鼠实验需要更大的剂量以增加老鼠新陈代谢速率来和人体实验进行比较。本实验获得了伦理批准并且所有的实验都符合美国伯克利动物保健中心和行政委员会的标准。海带的实验剂量(实验1) 大鼠被随机分为三组，每组八只：一支赋形剂，一次低剂量(175mgkg-1wtd-1)，一次高剂量(350mgkg-1
9、wtd-1)。墨角藻测量后注射入大鼠每天膳食的2g苹果中。使用苹果作为媒介有两个好处：(1)避免了因灌肠产生的紧张；(2)大鼠在摄入苹果的同时摄入了墨角藻，容易检测和确保墨角藻的摄入。制作阴道涂片并且每天记录检测发情周期的日志。四周后，所有大鼠恢复正常饮食。实验期间大鼠没有出现任何不良反应。时间过程实验(实验2)在早晨发情(由阴道细胞学检查得知)的19只处于正常发情周期的大鼠的尾静脉中抽取1 ml血液在血清激素实验中观察性激素是否随着时间的迁移而发生改变。抽血之后立即注射175mgkg-1wtd-1墨角藻。两到四周间，再次抽取早晨发情大鼠的血液。血液样本在室温下凝结成块，2000g.的速度下离
10、心处理10min。血清抽滤后在-20冷冻保藏用作后续分析时使用。高剂量实验(实验3)为了研究海带膳食在大鼠体内是否能使雌二醇达到较高的水平，发挥抗雌激素或孕激素的作用，选中8只雌激素水平50g/L的大鼠。在早晨发情期的基础抽血后给大鼠注射350mgkg-1wtd-1(P=0.002)5.91.9d。一周膳食后，在大鼠早晨发情时进行另一次抽血。动物性激素检测根据实验室诊断系统，按照操作规范使用ELISA试剂盒(No.DSL-10-6800)分三次测量血清孕激素。根据上文所述方法，使用放射免疫抗体检测重复检测17-雌二醇。天然海藻提取物将干燥，粉末状的墨角藻(50g)放入蒸馏水和乙醇以1:1的比列
11、混合的溶液中，墨角藻完全沉浸在溶液中，在室温下搅拌24h。提取物在4500g的速度下离心处理10min，进行无菌过滤，在旋转蒸发器中蒸发至干燥，在50%的乙醇溶液中重新溶解干燥物。天然海带提取物的分子量估计是300g/mol，这是一种制药行业测定未知生物活性的植物组成常用的方法。hlGC培养和剂量从8位在生育中心接受辅助生育治疗的女性体内获得颗粒细胞。对每位患者的细胞进行预处理，制片，培养。简而言之，颗粒细胞在含有0.1U/mL绒毛膜促性腺激素,抗生素，5%胎牛血清的基本培养皿中培养。48h后，细胞在乙醇溶液或25,50,75mmol/L海藻提取物中连续处理9d。最后一天的样本用来检测17-雌
12、二醇和孕激素。颗粒细胞激素的检测 参照前文所述方法使用RIA商用检测仪(诊断产品)雌二醇和孕激素。雌二醇和孕激素受体结合检测 海藻提取物对ER，ER和PR-B的亲和力由前文提及的辐射竞争性结合实验决定的。简而言之，3种浓度的干燥海藻提取物稀释液(0.5,5,50mol/L)重新溶解在二甲基亚砜，与ER，ER，0.5nmol/L雌二醇溶液中，25下搅拌2h。在加入1mol/L己烯雌酚的情况下可能存在非特异性结合。为了检测到PR-B结合，海藻提取物用PR-B和1.4nmol/L放射性标记的孕激素在4下处理2。加入1mol/L孕激素的情况下可能存在特异性结合。用氚水总成检测芳香化酶活性通过上文提及的
13、在3H2O掺入含氚的雄烯二酮来测定芳香化酶活性。在含有300 nmol/L的雄烯二酮(10%,90%)的500L MEM中培育hlGC细胞，37下处理2h，观察海藻提取物存在和不存在的两种情况(10,50,100mol/L)。数据分析 在动物实验1中，3组不同方法之间的差别可以通过两种方差分析估算。成对比较程序被用来估计膳食治疗组和膳食控制组两组之间的差别。对于所有其他的实验来说，使用商用数据分析软件分析组与组之间的差别，数据分析的结果P0.05被认为较好。对于放射性配体结合检测来说，IC50是用数据分析工具箱的非线性最小二乘法回归分析确定的。结论动物实验海带的实验剂量(实验1)30天内每天都
14、估算24只成年雌性SD大鼠的发情周期。大鼠膳食中含有175，350mgkg-1d-1(P=0.004)的海藻提取物的实验组结果表明，大鼠的发情周期随海藻提取物剂量的增大而增长。在空白对照组中，大鼠发情周期为4.30.96，,175mgkg-1d-1(P=0.05)剂量组中大鼠发情周期为5.41.7，350mgkg-1d-1(P=0.002)，剂量组中大鼠发情周期为5.91.9。深入研究得出，海带治疗100%显著增加了动情周期的发情时间长度(P=0.002)。具体地说，动情周期的平均值为空白对照组0.970.22，175mgkg-1d-1(P=0.05)剂量组的平均值为1.40.54，350mg
15、kg-1d-1,剂量组(P=0.002)的平均值为2.10.88.海带治疗对发情前期和发情后期的天数没有显著影响。检测到0,175，350mgkg-1d-1,剂量组的整个动情周期的天数分别为28.63.1,30.53.6,31.93.6。根据实验1可知，出去实验剩余的之外，5只大鼠停止了正常的发情周期。1只大鼠在发情期，4只大鼠在动情期。对雌二醇血清和孕激素水平的影响(动物实验2)175mgkg-1d-1的剂量持续两周，17-雌二醇水平的平均值从48.94.5降低到40.23.2ng/L(P=0.13),四周后同样的剂量水平只有36.72.2ng/L(P=0.02)比基本值降低了25%，表明随
16、着时间的推移剂量的作用越来越显著。空白对照组和治疗组的血清孕激素水平没有明显的差别。高剂量实验（动物实验3） 海带膳食治疗（350mgkg-1d-1）一周后，在高血清17-雌二醇水平的8只大鼠中，血清17-雌二醇水平下降了38%(P=0.02)(数据1)。6只大鼠的血清17-雌二醇水平还原范围为25-58%，其中有2只大鼠对海带没有反映。孕激素水平在高剂量的作用下没有明显变化。海带对人卵巢黄素化颗粒细胞的17-雌二醇和孕激素水平的水平 在hlGC细胞的培养中，50,75mol/L剂量明显减少了30-35%的17-雌二醇水平。海带治疗同时湿度提高了hlGC细胞中孕激素的水平，然而，只有50mol
17、/L的剂量能提升(P=0.03)。放射性配体检测在放射配体竞争性结合检测中，海藻提取物发挥了对雌二醇和ER，ER及ER-结合，孕激素和PR-B结合的阻碍作用。这些数据显示，提取物竞争性的结合ER，ER和PR-B，其中对ER的亲和力最高。hlGC加入海藻提取物后芳香化酶的活性没有明显变化(数据没有显示)。讨论本文我们通过监控大鼠的发情周期以及性激素水平还有hlGC细胞培养中雌二醇的产量，提出了额外能表明墨角藻具有抗雌激素的生物学作用的证据。具体地说，海带膳食在剂量控制的情况下整体提高了37%大鼠的发情周期，350mgkg-1d-1剂量组明显延长了大鼠的动情周期。海带膳食控制同时在大鼠雌激素产量方
18、面还发挥了显而易见的作用，导致循环中17-雌二醇水下降了18-33%。这些数据一致表明，我们能够观察遵循海带膳食治疗的女性到生理周期的延长，雌二醇水平的下降。深入讨论，本实验所用的剂量都是生物相关剂量，和日本人群摄取范围3-13g/d一致。先前的实验表明大豆和染料以黄酮对大鼠发情周期没有显著影响，只延长了10%的生理周期。跟大豆相比，海带在发挥延长生理周期起更重要的作用。在hlGC生物测定试验中深入研究了墨角藻的抗雌性激素生理活性，墨角藻提取物导致细胞培养过程中17-雌二醇水平下降了23-35%。这表明提取物同时具有抗雌性激素产生，增加其生物分解速率的作用。竞争性抑制，改变表达基因，翻译后修饰
19、P450细胞色素酶成类固醇或者进入17-雌二醇新陈代谢影响雌激素水平。然而，我们没有发现海带提取物有对芳香化酶的活性有抑制作用，被认为是一个植物成分发挥抑制酶活性作用的潜在分子靶点。更深一步研究海带提取物抑制hlGC培养过程中产生雌激素的实验仍在继续。另一个潜在的内分泌调节机制就是竞争性抑制性激素受体。海带提取物就像是一个雌二醇结合ER，ER的结合竞争阻碍剂，对ER选择性抑制力远大于ER。这些数据表明墨角藻中的成分能够通过降低雌二醇和ER，ER的亲和力成为雌二醇抑制剂。这两个受体在很多海藻组织中都能找到，在基因转录中可以作为配体激活受体的转录因。尽管抑制ER，ER的与雌性激素结合活性具有相似性
20、，ER，ER和其他配体的特异性结合可以通过他们在靶组织中不同的功能特性区别。在最近的研究报道中，没有证据表明SD大鼠的海带膳食治疗对孕激素有影响，只有在加入海带提取物的hlGC培养中孕酮有微量的增加。但是，前人有验证墨角藻可以改善女性黄体期缺乏孕酮表现出较高的雌二醇水平。这种差异原因可能是之前研究报道中反常的雌激素跟孕激素比值。这就证明雌二醇高度相关的胜利浓度是一个直接的阻碍3-类固醇脱氢酶的原因，结果导致人的黄体细胞孕激素收到抑制。那些高度循环的雌二醇，墨角藻的抗雌激素不仅消除产生雌二醇，同时也会通过缓解雌二醇对3-类固醇脱氢酶阻碍作用来增加孕激素构成。然而，海带膳食治疗对循环的孕激素水平潜
21、在的影响需要更大人群作为实验对象来研究。本实验的局限是所有大鼠的抽血都是在早晨发情期间雌二醇水平最高时候抽取的，但是孕激素水平不在最高水平。由于多次对每一只大鼠抽血，我们不能获得大鼠发情其他时期的血液样本。但是我们能够决定海带提取物对PR-B的相关结合的亲和力，说明海带可能是PR的抗体。化学家分析墨角藻可能含有潜在的相关生物活性成分。现在，我们正在努力识别墨角藻中的抗雌激素物质。可能的成分是在有些褐藻种类中含有生物活性多酚，硫酸多糖，岩藻甾醇。墨角藻中含有15%的多酚，其中25%的多酚是高相对分子量。墨角藻中发现最多的多酚类物质是低聚物，高聚物和1,3,5-联合间苯三酚多酚，这些成分便显出能发
22、挥活性杀菌作用，对活性氧的抑制作用，还能抑制免疫性缺陷病毒的逆转录酶和蛋白酶。褐藻多糖硫酸酯中的硫酸多糖也能在褐藻中发现。最近研究发现褐藻多糖硫酸酯具有抗病毒，抗增殖，抗血管阻塞，抗肿瘤作用。因为这些复杂的化学组成，这些最珍贵的天然具有内分泌调节功能的物质组很难被阐明，针对各个化学组成的研究还在进行在。本实验的数据表明，摄入褐藻可能是亚洲人性激素依赖性癌症发病率较低的原因之一。但是，我们在实验中只是一来自美国北部的墨角藻作为研究对象。二亚洲地区主要使用的是褐藻，日本地区主要食用的海带包括裙带菜而不是墨角藻。在下最终结论之前，还要继续用营养流行病学研究那些常见海带的内分泌调节机制跟再整风险之间相关关系。总而言之，检测膳食中的组成成分只是能简单说明膳食中的雌激素减少作用能降低雌激素依赖癌症。此外，墨角藻中的识别抗雌激素的成分也可能会让我们发现新的雌激素受体，可能日后会被应用到雌激素依赖癌症的预防或是应用中。最后，单独识别这些组成成分的工作仍在继续。
探究墨角藻调雌性SD大鼠和人卵巢黄素化颗粒细胞内分泌激素的作用机理
