蛋白表达纯化步骤

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1、证明目的蛋白有表达1挑取一单菌落接种于含（AMP,终浓度为100g/ml）的3ml液体LB培养基中37C, 250rpm 培养过夜。2将过夜培养菌液以1:100转接于含抗生素的100ml液体LB中，37C, 250rpm 3.5h （大量 培养至OD600=0.6左右）3取出1ml菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养物加入IPTG至终浓度为1mmol/L。继续震 荡培养4h。4以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液做对比，SDS-PAGE检测。结果如图一1未诱导 2未诱导 3诱导后 4诱导后二表达的情况，是可溶还是沉淀1将上述的37C诱导的菌液离心（4C，12000,5min），弃上清（LB培养液），沉

2、淀重悬于 0.9% NaCl溶液洗菌。2重悬于0.9% NaCl溶液的菌体离心，（4C，12000,5min）,弃上清（0.9% NaCl溶液），得 菌体，称菌体重量，悬于8ml PBS （PH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50100mg/ml的菌液 终浓度。3超声波破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声波设置如下：功率：400W工作：15min间隔：45s全程时间：30min （30次左右）以菌液由白变透明， 且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出 来后会粘稠，可能加DNA酶会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没有加 DNA酶），不然分

3、不开）4将超声波破碎的菌液离心（4C，12000,5min），分别收集上清和沉淀，各取1ml,加入1ml 2X上样缓冲液，沸水浴10min, SDS-PAGE检测。结果如图21： pT-32aA3 诱导 I.徹 2: pET-323A3导沉淀三探索可溶表达条件有上述结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性表达，但是量很少，大部分以包 涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明蛋白的表达量很咼，上清可溶性蛋白的 可操作性等因素的干扰优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶性蛋白的表达条 件，最终加大上清可溶性蛋白的含量，以便实现下一步实验的进行。影响包涵体形成的因素有很多，如诱导

4、温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所 以设置低IPTG浓度O.lmmol/L，在不同温度，诱导时间上对照的表达对照：1）37C, 250rpm, 5h2）30C，180rpm，10h3）23C，90rpm, 30h过程：挑取一单一菌落接种于氨苄（Apm,终浓度为100g/ml）的3ml LB液体培养基中37C， 250rpm培养过夜，将过夜培养的菌液以1:100转接于含上述抗生素的50ml+50ml+60ml液体 LB中，37C，250rpm，3.5h （大量培养OD600=0.6左右）。从60ml培养液中取10ml做未 诱导对照，标记 3 个 50ml LB 培养菌液：1） 37C

5、，250rpm，5h 2） 30C，180rpm，10h 3） 23C，90rpm，30h 都分 5 次取样：37 C每1小时取一次（取10ml）30C每2小时取一次（取10ml）37C每5小时取一次（取10ml）诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2X上样缓冲液，沸水浴 10min，SDS-PAGE 检测。SDS-PAGE 检测：1 37C M1 2 3 4 5五样的上清和沉淀2 30C M1 2 3 4 5五样的上清和沉淀3 23C M1 2 3 4 5五样的上清和沉淀4不同温度下最优可溶性表达比较结果如下：1:371 澜 2： 371沉洽 3： 372卜,汹 4:37

6、2沉淀,5： 373上泡 G： 373沉込图4图4 3LC条件卜五个样的上悄和沉淀1:301 卜温 2: 301 沉淀，3: 302 上湖 4: 302 沉険，5: 303 H此 6: 303 沉爬.7: 304 上淸,8: 304 沉淀,9: 30510: 305 沉淀图5 23P条件下五个样的上沱和況沈1： 231 皤 2: 231 沉淀.3:232 湍 4: 232 沉團 5: 233 上勒 6: 233 沉淀,7: 234 上？R 8： 234 沉海 9:235 卜制 10: 235 沉淀阳改不同湿度卜的最忧叮港表达1： 234 上油 2: 2343:和3 上淸生 3D3加淀，5: 3

7、73.httn 6: 373沉淀，由图可知，23C条件下，明显提高上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶性表达平衡，即 20h以后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即无论如何改变条件，可溶性表达已到极限， 所以无需探索更低温度等条件。四大量制备，表达与纯化配制1L LB液体培养基，分装成100mlX 10瓶，分别有利于大肠杆菌生长和后续操作。 诱导培养：挑取：挑取一单一菌落接种于氨苄（Apm,终浓度为100g/ml）的3ml X5管LB 液体培养基中37C，250rpm过夜，将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100ml X10瓶液体LB中，37C，250rpm，3.5h （大量培养至OD

8、600=0.6左右），取出1ml菌液为 未诱导的电泳对照，剩余培养物加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L, 23C，90rpm， 继续震荡培养20h。破菌收集上清：分别离心（4C，12000,5min），加8mlX10管PBS （PH7,0）缓冲液重悬后, 冰浴条件下超声波破碎（400W, 15s, 45s, 30min）收集上清（8ml左右X 10管） 稀释过滤上清：8ml左右X10管菌液用PBS （PH7.0）缓冲液稀释为2倍，并过0.45nm滤 膜，取1ml留样过镍柱纯化（8ml左右X10管X2倍=160，分2次过柱，每次80ml）A用缓冲液I （PBS PH7.0缓冲液）再洗

9、5个床体积，流速为2ml/minB将稀释过滤后的上清上样，流速为1ml/minC用缓冲液I （PBS PH7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2ml/min,使目标蛋白充分挂 柱。D用50ml的咪唑的缓冲液III，洗去杂蛋白，流速为2ml/min,并收集洗杂峰 E用50ml的咪唑的缓冲液III，流速为1ml/min,并收集洗脱峰，收集洗脱液F将收集洗脱液用15ml超滤离心管首次超滤浓缩，收集各次浓缩液，分装成每管1.5ml,取 1ml 4C备用，其余-80保存G各取1ml过柱前，挂柱穿透,洗杂液，洗脱液加2X 上样缓冲液，沸水浴10min, SDS-PAGE 检测。六、多克隆抗体的制备纯化蛋白加等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂（我用枪吹了2个多小时），采用皮下、皮 内和肌肉注射的方法进行第一次家兔免疫。再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次静脉加强免疫时 则不用佐剂。每次免疫抗原量为400 -500g/次（1mL左右），最后一次加强免疫7-10 d后釆血。将所采血 4C凝结过夜，取血（3000rpm10-15min）,加入NaN3后于4C保存（我是直接80保存，什么都没加）。 用琼脂双扩散的方法测定抗血淸效价（还没做）