现代育种原理与方法

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1、蛋白质相互作用及其研究方法摘要：随着人类基因组和其它物种基因组序列测定计划的顺利完成，生物学的研究从 基因组时代步入后基因组时代。作为后基因组时代的重要研究领域之一的以蛋白质间相互作 用研究为中心发展起来的蛋白质组学已经成为当今生命科学研究的热点和前沿领域。研究细 胞内所有蛋白质的相互作用即相互作用组，分析各种蛋白质复合物的组成及其作用方式对于 我们理解生物体的复杂运行机制至关重要。关键词：蛋白质组学噬菌体展示技术酵母双杂交系统串联亲和纯化随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能，一门新的学科一一蛋 白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体，其功能往往是通过

2、蛋 白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的，这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活 动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此，对于蛋白质 相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一1。在过去的几年时间里，研究 人员提出了很多的方法来研究蛋白质相互作用，有生物方法，也有计算生物学的方法。在这 些方法之中，基于蛋白质序列的预测方法得到了极大的关注。这类方法不需要先验知识，可 以广泛地用于蛋白质相互作用的研究之中。1. 蛋白质蛋白质相互作用概述1.1蛋白质的功能蛋白质是由氨基酸通过肤键构成的生物大分子化合物，生物体中的每一个细胞和所有重 要组成部分都有蛋白质参与

3、。一些重要的蛋白质功能包括：（1）酶的催化，例如淀粉在消化 道内由于淀粉酶的催化作用，迅速的被水解成单糖和双糖；（2）运输和贮存，例如在细胞膜 中，许多膜蛋白起运输葡萄糖、氨基酸等营养物质的作用；（3）调节蛋白，例如激素通过与 靶细胞相互作用发挥代谢上的作用；（4）机械支持，例如骨头和皮肤的拉力强度是由于存在 胶原蛋白。大多数结缔组织主要由它构成；（5）保护蛋白，例如免疫系统中抗体蛋白保护生 物体不被其它生物入侵或保护生物体免受损害。由于高通量测序技术的发展，多个物种的基因组被测序。但是在这些基因组中大部分基 因所表达的蛋白质的功能是未知的。此外，由于蛋白质功能的复杂性和多样性，很多蛋白质 还

4、有未被发现的功能。目前利用计算方法对蛋白质功能进行预测和注释已成为越来越有效的 一种手段。细胞内大多数蛋白质主要是通过蛋白质一蛋白质相互作用来实现其功能。蛋白质相互作 用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列重要生 理活动的基础。我们可以利用蛋白质之间的相关性，对未知功能的蛋白质进行注释,也就是 根据蛋白质相互作用网络中某个蛋白质的连接情况从整体水平上预测蛋白质的功能2。1.2蛋白质的相互作用蛋白质是细胞生命活动的重要执行者和调控者。尽管有一些蛋白质是以单体的形式发挥 作用，但大部分蛋白质却是通过与其它蛋白质或者配体分子结合来参与细胞中的生命活动。 蛋白质分子

5、的相互作用包括多种方式，有蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用， 蛋白质-RNA相互作用等。蛋白质-蛋白质相互作用(Protein 一 protein interaction,PPI)指的是一个蛋白质与另一个蛋 白质之间的相互关系，它们之间可以直接接触(物理相互作用)，也可以不接触，而仅是功能 上关联(遗传相互作用)。蛋白质一蛋白质相互作用在生命活动中起着核心作用，例如：DNA 复制、转录、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息转导等众多生命过程中均涉及到蛋白质相互 作用。蛋白质与蛋白质之间相互作用的研究将能够从分子水平上揭示蛋白质的功能，帮助揭 示生长发育、新陈代谢、分化和凋亡等细胞活动的

6、规律。同时，正确理解蛋白质相互作用也 为探讨疾病机理、疾病治疗、疾病预防以及药物靶点发现和药物设计等方面提供了重要的理 论基础。1.3蛋白质相互作用机理蛋白质相互作用在很大程度上是由疏水效应驱动的，氢键和静电相互作用也起着至关重 要的作用。此外，共价键也是很重要的。蛋白质相互作用的物理化学原理是一般性的，在体 外检测到的很多蛋白质相互作用是生物实验中的过表达或者晶体效应造成的，从而加大了蛋 白质相互作用研究中的复杂性。为了能够准确预测蛋白质相互作用，我们也需要从化学角度来研究蛋白质之间的相互联 系，包括形状互补、氨基酸残基组织、以及物理/化学结构成分对相互作用稳定的贡献等。 蛋白质是通过其表面

7、区域与另外一个蛋白质发生相互作用的。因此对蛋白质相互作用研究 的焦点也就集中在蛋白质的结合表面这一部分。一般我们是通过计算残基或原子的溶剂可及 表面积(solvent accessible surface area,SASA)来判断蛋白质中哪些残基或原子是处于蛋白质 结合面的。如果一个蛋白质分子与另一个蛋白质分子之间有相互作用，那么位于其中一个蛋 白质分子表面的原子将会与对应的另一个蛋白质分子表面的原子发生相互作用。为了理解蛋 白质分子间的相互作用，人们对蛋白质相互作用结合面的性质作了深入研究。这些性质包括 相互作用的强度!结合面的形状及组成!残基的疏水性、进化保守性、溶剂可及表面积和二级 结

8、构等。虽然这些属性对于我们理解蛋白质相互作用来说都是必要的，但它们对蛋白质之间 结合的描述还是远远不够的。这也是目前要正确预测蛋白质相互作用所面临的一个很大困难3。1.4蛋白质结合面中的热点残基热点残基通常被定义为丙氨酸突变后引起结合自由能的变化值大于等于2.0kcal/mol的 那些结合面上的残基。热点残基有聚集在一起的倾向，它们之间的相互接触而形成了一个相 互作用网络，我们称之为热区(hot regions)。由于结合面大小的不同，一个蛋白质相互作用 结合面上可能有多个热区。在一个热区内的热点残基对复合物的稳定所发挥的作用是协同性 的；而各个热区之间是相互独立的，它们对蛋白质复合物的稳定性

9、作用则是具有累加性的4。这就说明在紧密包装的热区之间，是有一定的空隙的，从而使得蛋白质之间的结合是有 一定的柔性的。这与蛋白质的折叠过程是有一定的相似性的。2. 蛋白质相互作用的实验方法最初研究蛋白质相互作用的方法都是基于生物实验的方法，诸如电泳，层析，质谱分析， 核磁共振等技术。这些生物实验技术在蛋白质组学的相关研究中自始至终一直发挥着极其重 要的作用。随着新技术的发展，蛋白质研究进入了新的阶段，高通量技术的发展使得在更短 的时间内鉴定出更多的蛋白质及其相互作用关系成为可能。迄今已发展了包括经典的噬菌体 展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技 术、表

10、面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法，为蛋白质 组学的发展奠定了坚实的基础。2.1噬菌体展示技术(PDT)1985年，美国Missouri大学Smith博士等人5将RI核酸内切酶基因片段连接到丝状噬 菌体fd编码次要外壳蛋白的基因III中，成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬 菌体颗粒。后经验证，该噬菌体能被EcoRI核酸内切酶抗体有效中和，说明展示在噬菌体 外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性，这一试验的成功标志着 噬菌体展示技术(Phage display techniques, PDT)的诞生。噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立

11、之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究 的。1990年Scott等人6利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库，该文库由特定长度的随 机短肽组成，理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方式。由于蛋白质间的 识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸，所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛 选，就能得到之结合的短肽序列，根据此短肽的序列，就可以得到与目的蛋白相互作用所依 赖的氨基酸残基7，从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别，酶与底物的结合等等，突 破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。噬菌体展示技术最大的特点在 于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和

12、生物活性，建立起了基 因型和表现型之间的一致性。2.2酵母双杂交系统(Y2H)酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等8提出并初步建立 的，主要用于研究真核生物的蛋白质，到现在，双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作 用的标准方法，并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角 色9。Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的详细了解。 GAL4包括两个可以独立的结构域:N末端的DNA结合域(DNA-binding domain,DNA-BD)和 C 末端的转录激活域(Transcript

13、ion activating domain, DNA-AD )。DNA-BD 可以与 DNA 分子 的上游激活序列结合，DNA-AD则可以激活下游基因的转录，只有当两者在空间上充分接近 时才会共同作用激活转录活性。双杂交技术正是利用了 GAL4的这一特点，将欲研究的两个 目标蛋白的编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合，构建成两个杂交系 统；再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株；若两个目标蛋白发生相互 作用，则会使DNA-BD和DNA-AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。2.3串联亲和纯化(TAP)串联亲和纯化(Tandem affinity puri-fic

14、ation，TAP)是 1999 年 Rigaut10等人共同提出 了一 套分离复合蛋白的新方法，兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点，为蛋白质 复合体的分离鉴定提供了一条新路径。串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化 蛋白的一端加一个TAP标签，该标签由IgG结合结构域(ProtA)及一个钙调蛋白结合多肽 (CBP)组成，结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性 的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因，温和裂解细胞，获取细胞抽提物，将抽提物 加入IgG亲和柱，TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液洗脱掉大部分非 特异性结合物

15、和杂蛋白后，再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙 离子参与下，被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充分洗脱就可以 进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。3蛋白质相互作用研究方法展望机体细胞内蛋白质之间相互交叉作用形成网络，构成各项生理活动的基础。因此了解、 阐明蛋白质之间相互作用的机制意义重大。各种新的研究技术不断涌现，尤其随着生物信息 学的出现，多种方法技术并存，相互间交叉互补，已愈来愈成为研究蛋白质相互作用研究方 法的主要特点，对于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘具有重大的意义，势必 会引导蛋白质组学的发展进入一

16、个全盛时期。参考文献1 .王海波，安学丽，张艳贞，等.蛋白质相互作用研究方法及其应用J,生物技术通 报,2006： 167-170.2 . Strong M, Malliek P, Pellegrini M, etal. 2003. Inference of Protein function and Protein linkages in Mycobacterium tuberculosis based on prokaryotic genome organization: a combined computational approach J. Genome Biol,4(9):R59.3

17、.夏俊峰.2010.蛋有质相互作用及其结合面热点残基的预侧方法研究D.中国科学 技术大学博士学位论文.4 . Keskin O,Ma B,Nussinov R.2005. Hot regions in Protein-Protein interactions: the organization and contribution of structurally conserved hot spot residuesJ:Journal of molecular biology, 345(5):1281 一 1294.5 . Smith G P. Science, 1985, 228(4705): 13151317.6 . Scott JK, et al Science, 1990, 249(4967): 386390.7 . HoessR H. CurrPharm Biotechno,l 2002, 3(1): 2328.8 .Fields S, et al. Nature, 1989, 340(6320): 245246.9 .Serebriiskii I G, et al. Mol Cell Proteomics, 2005, 4(6): 819826.10 . Rigaut G et al Nat Biotechnol 1999, 17(10): 10301032.