细胞培养技术笔记

《细胞培养技术笔记》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养技术笔记（4页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、CO2培养调节pH本身分解HCO3可逆H+ + CO2平衡。于是溶液中酸碱中和就不关CO2 的事了原代鸡胚成纤维细胞可以传代，但是最多传2代就不行了，表现为极易衰老，细胞形态不佳. 所以一般我们选择传1代.现在有CEF传代细胞系,DF1，但是很娇贵，营养要求比原代的要苛 刻.传代和做原代用的试剂差不多：无EDTA，Hanks ，10%或8%血清的DMEM或MEM (根据自己手头上的试剂选择)。胰酶和培养基先37度预热，否则细胞消化不开，成团细胞 多，死细胞多。其中梭形的细胞应该是成纤维细胞。左下方的多边形或圆形细胞应该为上皮样细胞。最 大的干扰就是上皮细胞。细胞种类：鸡胚成纤维细胞传代细胞系(

2、UMNSAH/DF-1)培养的天数：2放大倍速：倒置显微镜X50培养基种类：DMEM+10%小牛血清，最好39度培养，37度也可细胞状态与特征简述:成纤维状，梭形，生长速度中等，贴壁生长细胞培养用水，必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸 水或纯净水。在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、 温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活 性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时， 可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。细胞

3、培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56C水浴中灭火30分钟后，再经过抽 滤方可加入培养基中使用。过滤消毒：1. 安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，通常使用孔径0.45微米和 0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜 光面朝上。用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。2, 抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。3. 分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。4, 使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4C时两周有效）。HEPES溶液：HEPE

4、S的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N - ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能 力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。过滤除菌，分装后4C保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以 可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如： 称取4.766克

5、HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸 和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一 定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4C下放置1周可分解50%，故应单独 配制，置于-20C冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可 以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。

6、配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于 三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20C 保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。?配制培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值 最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。培养基1. 液体培养基贮存于4C冰箱，避免光照，实验进行前放在37C水槽中温热。2. 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不 佳，可以再添加适量glutamine o3. 粉末培养基配制（以1升为例）：3.1, 细胞培养基通常须添加10%血清，

7、因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为 7.2-7.4o NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误 差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体 调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时 培养基的pH易发生改变。3.2, 材料：纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要），粉末培养基，NaHCO3，电 磁搅拌器，无菌血清瓶，0.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体3.3, 步骤：3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml mil

8、li-Q水中，搅拌使其溶解。3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5分钟。3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液 之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入 CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。3.3.4. 以0.1或0.2 mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种 类、日期、瓶号等，贮存于4Co （血清亦可加入培养基中一起过滤）3.3.5. 配制之培养基配

9、制须作生长试验与污染测试。酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为 紫色。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。血清1. 血清必须贮存于-20-70C,若存放于4C,请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %,必 须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将 血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3. 瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法)：-20C或

10、-70C至4C冰箱溶解一天，至 室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由-20C直接至37C 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。4. heat-inactivation是指56C, 30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃 均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contrac

11、tion of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。5. 勿将血清置于37C太久，若在37C放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。6. 血清之沉淀物6.1, 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性 及解冻后血清中存在之血纤

12、维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。 若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm, 5min去除，或离心后上清液可以加入培养基 中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。 有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37C 中欲培养此“微生物“，但在37C环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增 殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长， 但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。35当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。 血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞 达到毒性水平。36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为 一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。37大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起 一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。38在溶解的一周内使用贮存在4C冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4C就可能 开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。