绿藻栅藻培养

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1、绿藻栅藻培养藻类，特别是单细胞藻类的营养丰富，含有动物和人生长发育所必需的营养 物质。自上世纪四十年代以来,各国学者都试图用藻类这一资源解决人类食物和 动物饵料的缺乏问题。另一方面，藻类可直接或间接的作为鱼类及其他水生动物 的饵料。1 藻类的培养方式藻类的培养方式，以藻类培养的目的要求而各种各样。但可分为密闭式培养 和开放式培养两大类。1.1 密闭式培养密闭式培养的目的是不使外界杂藻、菌类及其他有机体混入培养物中。将培 养液密封在与外界完全隔离的透明容器中，由此通气，搅拌，输送培养液及调节 水温和取样等设备，也都要与外界隔离。培养容器多为管状，也有池状，用有 机玻璃或透明的聚乙烯所料做成水平管

2、道，直立或斜立在地上，暴露阳光或人工 光照下。这种培养方式，成本高，好控制，产量亦稳定。1.2 开放式培养将藻类培养于敞开的容器(如水泥池、管道、木盆等)中。方法设备较简便， 可进行小量或大面积的培养。该法培养物中易发生敌害生物污染，但成本低，使 用较普遍，也是今后藻类培养所应采取的方式。开放式可分如下几种类型：(1) 开放循环培养：其特点式培养液借助循环水泵而不断循环流动。培养物 能循环，就可省却搅拌工作。(2) 开放非循环培养：其特点是培养液不循环流动，而定时由小管通入 CO2 和空气到培养液中；同时也起搅拌作用。此法在大面积培养中使用较普遍。优点 是设备简单，无需动力，水泵及大量的 CO

3、2 及通气设备。(3) 半开放循环培养：半开放培养是指培养容器或池，槽等场所虽仍敞开， 但有些部分密闭，或用塑料布覆盖。这种培养方式，利用管道，依靠动力，使培养液流动和通入含二氧化碳的空气。该方式设备复杂，但效果较好。2 藻种的分离为了要进行某种藻类的科学研究活大量培养，有必要把某种藻类与其他生物 分离。分离培养藻种，可分为两大类，一为单种培养，即藻类虽只有一种，但还 混杂细菌。另一为纯培养，即不仅藻类只有一种，亦无其它任何生物。纯培养比 较困难，一般的分离培养往往只能做到单种培养。主要根据培养的目的要求，及某一种类的生物学特征。藻类的分离主要有以 下几种常用方法。2.1 离心法将混合液用离心

4、机离心，水中不同藻体及细菌就以不同的速度下沉，因此得 以分开。这样将不同时间下从导管底的藻体取出，经镜检选定某种藻类最多的沉 积物，再加清水，继续离心，如此反复就可得到比较单纯的藻体，在接种相应培 养液中培养。该法可消除细菌，并增加纯粹分离的可能性，至少可作为藻种平板 培养的准备工作。另外，在水液中藻体含量较少时，可用此法集中藻体。但此法 不能做到使不同藻类完全分离。2.2 稀释法该方法用已消毒试管5只，在第一管盛蒸馏水10 mL,第25管都装5mL，用 高压蒸汽消毒，待冷却后，第1管用滴管滴入混合藻液12滴，充分振荡，使均 匀稀释。每次用消毒吸管，从第1管中吸取5mL滴入第二管中如前振荡，使

5、均匀 稀释。以后依次同样滴入第35 管，并都充分均匀稀释。然后把五个已盛又消 毒的琼胶培养基培养皿，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，分别滴入五个试 管的藻液各一滴，用力振荡，使藻液充分混乳培养基中。待冷凝后，把五个培养 皿放在受着漫射光窗口，一直到出现藻群时为止，在20C左右时，约10天即出现 藻群。用消过毒的白金丝取些藻群，进行琼胶固体培养基的不通气培养。此过程 反复多次，直至得到完全分离的纯藻种群为止。此法稀释要使用较多容器分组培 养，比较麻烦，但较易成功。2.3 微吸管法将水样在载玻片上滴成绿豆粒大小的一些水滴，这样可使每个水滴中有很少生物而便于分离；在解剖镜下用微吸管（口径小至0.0

6、080.16 mm,圆口，可自 行拉制）。将要分离的藻体吸出，用蒸馏水或平衡矿物质溶液冲洗数次，然后主 导成有培养基的小培养皿中培养，待生长旺盛后，再扩大培养。此法较适用于能 运动的藻类。2.4 趋向法利用藻类的特殊趋向性（如向光，向地等）不同而分离藻体。此过程反复几次 就可得到一定纯度的藻体。分离效果较好，只是不能应用于不运动的藻体。2.5 平板分离法在培养液中加入战培养液1.5%的琼胶，加溶解后，注入培养皿中，加盖后用15磅压力121C灭菌20分钟，即制成胶质培养基（也可用硅酸胶和明胶制备）。在 琼胶培养基放在40C以下的水浴锅内，开改用吸管注入混合藻液，摇匀，使之分 散在培养基平面上。之

7、后，可放在恒温箱内，用荧光灯照射，使藻群生长。再经 镜检，反复此法不断提纯，即可分离出较纯的藻种。2.6 固氮蓝藻分离培养法将一小片藻丝群接种到培养基上，几天后再用灭菌白金丝挑取生出的新藻丝 接种到平板培养基上。这样经几次分离接种就得到较纯的藻种。3 藻种的选择、接种和保存3.1 藻种的选择虽然藻类种类较多，但其中仅少数经过人工培养。应该研究在室外培养其他 藻种的可能性和他们生产的潜力，所选择的生物种应具有下列特征：（1）生长迅速；（2）对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；（3）蛋白质,脂类和糖类含量高,或有选择地积累一种特殊的代谢产物（如甘 油）；（4）无毒性,且易于收获。 根据系统的要求和

8、特殊的方法，还可有其他要求。3.2 接种再分离到单纯藻群后，就可接种到培养液中进行培养，进而移养扩大培养。 接种方法有液体接种和干藻接种。前者是将藻液直接加入培养液中进行搅拌，加 入的藻种分量视水温而定，水温较低（10C以内）时，多加;约占培养液总量的30 40%左右，水温适宜时（2530C左右），可加58%左右。后者是用干藻的藻体 接种，接种量为0.10.2%。3.3 藻种的保存一旦藻种分离得到，就要保存好以便在一定的时间内供接种用。为此，要将 藻种消毒，避免其他来源的污染。给以适当的光照和温度。在液体培养中，为了 快速增殖，可用54001X，再得到良好生长后（12周），培养液移到更低的光照

9、条 件（54011001X），以求缓慢生长及储藏。藻类在琼脂培养基上接种后的藻种，先 给予2700lx光照67天，直到得到良好生长，然后移至【540800lx光强的地方。 大多数藻类保存在室温下（1520C）即可，少数造中存活需较高温度。藻种接代 一致的频率视物种及贮存条件而不同，单胞藻及丝状不运动的物种可以每六个月 到十二个月移种一次，有鞭毛的物种移种次数要更频繁些。某些藻种曾成功地做 到了在液氮下长期保存。4 藻类培养管理及采收方法藻类培养的管理包括培养基养料的补给，光照及温度调节，CO2的补给，搅 拌，防污等。在培养过程中，补给的养料，要选择肥效速，并有持久性，来源较 广，价格低廉的种类

10、。一般都以有机肥料为补肥、光照、温度的调节视种类及季 节而定。室内照光一般都采用白炽电灯和荧光管。温度调节一般采用室内用白炽 灯照射培养物或用温室，安装电热管等升温，室外冬季升温较困难，主要采用玻 璃棚；用冷水管道降温，或经通风遮阳降温。CO2的补给一般通过空气压缩机或橡皮管将含5%CO2的空气通过培养物中。 搅拌使藻类培养不可少的一道工序.搅拌可使培养物均匀分布，水温均匀，利于 藻类生长，搅拌的方法一般为人力搅拌，风力搅拌，空气搅拌和磁力搅拌。此外 还有循环流动法。防污在藻类培养中很重要，对杂藻及细菌的防治主要采用石灰， 漂白粉，硫酸铜等试剂，用10.5ppmCuSO4防值杂藻的效果较好，当

11、有浮游动 物污染时，可施用化学试剂，杀虫剂等杀灭，如硫酸铜12ppm可杀灭轮虫，纤 毛虫；漂白粉4ppm对各种虫类均有效；食盐9%o，可杀灭轮虫；碘液5%o，再稀 释到十万分之一，可杀灭纤毛虫。培养物的采收的时间要适当，主要根据其密度 大小决定，采收的方法有：4.1 理浓缩(1) 离心法：国外使用最普遍。它利用离心力来把藻体与水液分离，是藻体 下沉达到浓缩目的。主要工具是离心机。(2) 重力沉降法：利用重力使培养物下沉而得到浓缩物。使用的工具是沉淀 器。(3) 遮光法和降温法：对趋光性强的藻类，如衣藻等进行遮蔽光线，使培养 物下沉而得到浓缩物。低温使藻类也有下沉现象。4.2 化学浓缩法用沉淀剂

12、如明矾，石灰等，使培养物下沉，而得到浓缩物。明矾0.30.4% ， 将之研碎，加入培养物中搅拌，半小时培养物大部分下沉，在612 小时后，全 部下沉。石灰一般是将其1 斤溶在100 200斤水中，制得饱和石灰水，其用量是 6%。但该两法沉淀的藻浓缩物的灰分较多。此外，较大体积的种类，如丝状体，非浮游性的藻类等可用过滤法采收。采 收后的藻浓缩物即可经干燥加工成饲料或其他原料。5 分析技术5.1 细胞计数显微镜法培养物中的个体数测定，是按照个体计数方法，测定和估计培养物单位容积 中的个体数。计数方法同浮游植物定量的方法。此外，也可以采用血球计数法。5.2 分光光度计法培养物的藻类密度也可用分光光度

13、计测定。当藻类密度较低时，光径中的细 胞数与测量到的光密度有一简单的几何关系。在藻类密度不大时，光密度大，细 胞数目就多，即可用测得的光密度值表示细胞数目。5.3 干重测定测定干重的增加量是生产估测方法中的一个最直接的方法，其步骤如下：(1) 取样从藻体培养液中取出有代表性的一小部分体积的藻液，取样时在以下 三点上要特别注意：a.将培养物搅拌均匀b.快速吸取样品以免沉积c.足够多的 样品(2) 分离取出样品后，用过滤膜过滤或用离心法把藻体与介质分开。细胞必须 洗过以除去盐分和其它污物，通常是用稀释的培养液或缓冲液。海洋藻类不能用 蒸馏水洗，以免质壁分离和细胞胀破。(3) 干燥一选择对特定有机体

14、最适的烘干温度.a.避免过热b.有好的重复性c. 对同一样品增烘1小时后，称得统一重量。(4) 测定结果的表示法所得干重测定值要以单位培养液体积的干重表示，室外的 培养池则用单位照光面积的干重来表示。2 配制藻类培养液的几条原则(1) 要有适量氮源(除固氮蓝藻外)，如氨盐、硝酸盐、有机氮等。硝酸 盐、氨和尿素常用作配方中的氮源，根据造中的性能和pH的最适点而定。藻类 的生长主要依赖氮的可利用性。大多数微型藻干物中含有79%的氮。因此在1 L培养液中生产10g细胞就至少需要500600mgL-iKN03。(2)碳源：无机碳通常是用含15%CO2的空气来供应的，碳的另一种供 应办法是用碳酸氢盐。选

15、用何种办法主要是根据藻类生长的 pH 最适点而定。( 3) 应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。(4) 要考虑各种盐类总浓度和 pH 是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节 pH。通常用偏酸的pH值来避免钙镁和其它微量元素发生沉淀。(5) 要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等(后几种包括 在土壤抽出液中）。培养基中的微量元素通常是用早已证明有效浓度的混合溶液 来提供的（浓度在ugL-i级范围）。然而，这些微量元素的组分对藻类生长是否必 须却不能总能显示。为增加微量元素的稳定性，常用柠檬酸盐和EDTA作为螯合 剂。（6）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。（7）要添加适量生长物

16、质如维生索Bl、B2等（包括在土壤抽出液中）。3 培养基配制目前绿藻、栅藻、小球藻作为大型枝角类食藻虫的培养驯化食物，在实验室 人工培养中，主要使用Mil、BG11或水生四号培养基。3.2 M11培养基Mil是实验室蓝绿藻培养常用培养基，其配置成分如下表:化学成分浓度（mg/l）硝酸钠NaNO3100磷酸氢二钾K2HPO410硫酸镁MgSO4-7H2O75氯化钙CaCl240碳酸钠Na2CO320柠檬酸铁Fe cltraie xH2O6EDTANa2 EDTA 2H2O1蒸馏水N： 16.5 mg/lP： 1.78 mg/lPH： 83.3 BG11培养基实验室常用BG11培养蓝绿藻，但四尾藻

17、、月牙藻用此培养基更好，其配制成分如下表：化学成分溶液浓度(g/100ml)培养液组成(ml)硝酸钠NaNO31510磷酸氢二钾K2HPO4 3H2O0.410硫酸镁MgSO4-7H2O0.7510氯化钙CaCl2 2H2O0.3610碳酸钠Na2CO30.210柠檬酸Citric acid0.0610柠檬酸铁Fe cltraie xH2O0.0610EDTANa2 EDTA 2H2O0.0110a5液1蒸馏水Distilled water919A5液(微量兀素溶液)配制1000ml水中h3bo3硼酸61.0MnSO4 H2O硫酸镁169.0ZnSO4 7H2O硫酸锌287.0CuSO4 5H

18、2O硫酸铜2.5(NH4)6Mo7O24 4H2O钼酸铵12.53.4 水生四号水生四号即常用的水生四号培养液，为单细胞绿藻(栅列藻)培养液。其配方如下所列：(NH4)2SO4 0.200gCa(H2PO4)2 H2O+2( CaSO4 2H2O)0.030gMgSO47H2O 0.080gNaHCO 3 O.lOOgKCl 0.025gFeCl3 (3%)0.150mL土壤浸出液 0.500mL蒸馏水lOOOmL藻类接种及注意事项：1. 试验用三角瓶(500ml)酸缸浸泡洗净，之后放入培养基，培养基的量在总容 积的1/3 （200ml）左右，一般我们购买的藻种浓度很高时，接种时接入5ml 即可。2. 121C下，高压灭菌锅内灭菌30min。3. 灭菌完成后，等瓶中的培养基完全冷却后，根据需要开始接入藻种。4. 接种过程应在无菌操作台中进行，并且之前要对操作台进行30min的紫外灭 菌。（注意，不可将藻种暴露于紫外灯下）5. 在24-27C下，光照2000lux左右光照下进行培养。如藻量培养量大（10L瓶 子，则需要曝气）。不曝气的情况下，则需人工摇动3-4次/天。