三丁基氯化锡对哺乳动物生殖毒性及作用机制

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1、三丁基氯化锡对哺乳动物生殖毒性及作用机制 三丁基锡(tributyltin，TBT)曾主要作为船舶防污油漆广泛使用，后来发现TBT对海洋生物产生严重危害，尤其致软体动物发生性畸变，致使种群退化、数量锐减1，于2003年禁用。由于其长期残留性，即使在停用相当长时间后，海水和底泥中仍存在TBT，继而在海洋生物中蓄积，其富集因子大约在500025000之间，且经蒸煮后仍会存在，提示食用海产品可能存在TBT的潜在危害2。三丁基氯化锡(tributyltin chloride，TBTC)是TBT在水中的主要存在形式。因而本文就TBTC对哺乳动物的生殖毒性及其作用机制的研究进展作一综述。1TBTC对哺乳动

2、物的生殖毒性研究表明，环境中的许多化学物都具有干扰内分泌系统的作用，这些化合物被称为环境内分泌干扰物，TBT就是其中一种。这些物质影响生物的生殖功能，干扰体内激素的分泌，造成生殖和遗传方面的不良后果。TBTC对哺乳动物的生殖毒性研究多集中在对雄性动物的影响及其机制，而对雌性动物的影响多是研究孕期暴露导致的胚胎毒性。11胚胎毒性在妊娠不同时期以不同剂量TBTC对妊娠大鼠进行染毒，可导致不同的结果。一定剂量的TBTC在大鼠妊娠早期暴露引起不孕。Harazono3，4等以0，81，122，163mgkg TBTC对妊娠第07d的大鼠进行灌胃染毒，于妊娠第20d处死，观察妊娠结果。发现122和163m

3、gkg TBTC剂量组的未植入率比对照组明显增高。所有成功怀孕的大鼠中黄体数、植入数和吸收胎数无明显差别，并且所有处理组的畸胎率也未见增高。表明在妊娠早期接触TBTC能引起不孕，但不引起畸形。研究还发现，在大鼠妊娠第03和第47d以163mgkg及以上剂量的TBTC给药，能分别引起植入失败和植入后胚胎吸收。通过对假孕大鼠(将成年雌性大鼠与具有交配功能但不能生育后代的成年雄性大鼠合笼，在阴道涂片上发现精子时，就称这些雌性大鼠为假孕大鼠)以灌胃方式给予TBTC进行进一步研究，发现在假孕第03或47d给药163mgkg及以上剂量组的大鼠在假孕第9d时子宫重量和血清孕酮水平显著下降；在03d给药的81

4、mgkg及以上剂量组在假孕第4d出现血清孕酮水平显著下降。而TBTC对卵巢的重量和黄体数没有影响。因此，推测TBTC抑制子宫蜕膜细胞反应，并降低孕酮水平，最终引起早期吸收胎发生。TBTC在妊娠中期暴露会引起流产及胎儿畸形。Ema5,6等分别在大鼠妊娠第79，1012，1315d 3个阶段，以25,50,100mgkg TBTC灌胃给药，发现孕鼠在妊娠第799d接触TBTC，流产率明显高于妊娠第1315d，而在妊娠第1315d接触TBTC，幼鼠的畸形率最高。之后进一步研究了TBTC的致畸敏感期，发现TBTC对胚胎的最敏感致畸时间为妊娠第8和第1114d。TBTC在整个妊娠期暴露会引起鼠仔数量减少

5、、体重减轻、肛门与生殖器距离增加但性别比未发生改变。Ogata7等给怀孕Wistar大鼠饲料中添加5，25，125mgkg TBTC后饲养，发现125mgkg组鼠仔的数量、体重、活胎百分比、体重增加率均明显下降，雌性鼠仔的开始睁眼和阴道张开的日期延迟，发情周期减少等。而且，所有处理组的鼠仔肛门与生殖器距离增加，呈剂量-反应关系。提示从受精开始暴露于TBTC会影响雌性新生鼠的性发育和生殖功能，还可能使其雄性化。后来，Adedayo8等分别在SD大鼠妊娠第019和第819d以0，025，25,10，20mgkg剂量的TBTC给孕鼠灌胃给药，在妊娠第20d处死孕鼠，检测妊娠结果。发现植入后胚胎吸收发

6、生率显著增加、胎仔数降低、胎儿重量降低。但处理组胎鼠未发生外观上的畸形，性别比也未发生明显的改变。这与Ema的研究结果中TBTC引起胎鼠外观畸形不一致，可能是剂量相对低的原因。研究发现，妊娠第019d给药组中除20mgkg剂量外其他组均发现雄性胎鼠肛门与生殖器距离显著增加；而妊娠第819d暴露组则没有变化。20mgkg暴露组胎鼠的低体重(低于该组平均体重的075)率显著增加。在妊娠第019d给药组中10和20mgkg剂量组中胎鼠发生在胸骨节的胸骨裂发生率与对照相比显著增高，母鼠血甲状腺素(T4)和碘甲腺氨酸钠(T3)的水平均显著下降；妊娠第819d给药组中，25和10mgkg暴露组的母鼠血T4

7、显著下降，而T3水平没有变化。因此，推测母鼠甲状腺激素平衡会影响有机锡对胎鼠的发育毒性。以上研究均是TBTC的体内胚胎毒性，曾怀才9等采用全胚胎培养技术，研究了TBTC的体外胚胎毒性。将85d龄昆明种小鼠胚胎置入含不同浓度TBTC的大鼠离心血清中旋转培养48h，观察体外培养的小鼠胚胎生长发育和组织器官形态分化的变化，发现TBTC在005mgL以上时能诱发卵黄囊生长和血管分化不良，胚胎发育异常率增高；010mgL以上时能诱发脑小、心脏畸形、前肢芽小或无、无后肢芽。说明在体外实验条件下，TBTC对小鼠胚胎具有胚胎毒性和致畸性。12对雄性生育力的影响在不同发育时期接触TBTC的雄性大鼠，生殖器官重量

8、下降、精子数减少、激素水平改变，影响大鼠的性成熟及生殖功能。Minoru10等研究了TBTC对2代Wistar大鼠雄性生殖系统的影响。对雄性大鼠以5，25,125mgkg TBTC添加入饲料中 ，第1代(F1代)于出生后第119d处死，第2代(F2代)于出生后第91d处死。发现125mgkg剂量组的2代大鼠均出现睾丸和附睾的重量下降，精子数下降，并且发生病理改变，包括生精上皮、精子细胞的空泡化，精子排放延迟。F1代中125mgkg组和F2代中25,125mgkg组的大鼠前列腺重量分别下降到对照组的84，84和69；血清中17-雌二醇浓度分别下降到对照组的55，78和57，而黄体生成素(LH)浓

9、度并没有下降。这些变化和芳香化酶抑制引起的变化相一致，因此， 推测TBTC可能是雄性大鼠睾丸中芳香化酶的弱抑制剂。Wook11等对出生35d的青春期雄性SD大鼠以5，10，20mgkg TBTC连续灌胃给药10d，停药5周后处死。发现10mgkg剂量组大鼠的附睾中精子数明显减少，20mgkg剂量组大鼠的附睾及睾丸中精子数都明显减少，并且精子的运动能力明显下降。YU12等也以同样剂量和方式研究发现，10,20mgkg TBTC处理组和10mgkg TBTC与10mgkg氟他米特(雄激素拮抗剂)混和液组大鼠与阴性对照组比较精囊重量明显降低，且精囊和附睾小管中细胞碎片和脱落细胞的数量增加；混和液组还

10、使大鼠血清中雄激素水平明显增加，提示青春期雄性大鼠接触TBTC会使生殖系统紊乱。Grote13等给出生23d的雄性Wistar大鼠以40mgkg甲基睾酮和05，15mgkg TBT连续灌胃给药30d，发现所有处理组的大鼠与对照组相比生殖器官重量减轻，且15mgkg TBT组大鼠睾丸中睾酮和血清LH浓度下降，说明雄激素合成减少。因此，推测青春前期雄性大鼠接触TBT会影响其性成熟。2TBT对哺乳动物的生殖毒性机制研究现状TBTC对雄性生殖系统影响的研究发现，在不同发育时期接触TBTC的大鼠，睾丸中睾酮浓度下降，血中雄激素水平增加、17-雌二醇浓度下降。这些改变可能与TBTC对雄激素的合成代谢与分解

11、代谢影响有关。21对睾酮合成代谢的影响已知睾丸间质细胞分泌雄激素，主要为睾酮。睾酮是C-19类固醇激素。在间质细胞内，胆固醇经羟化、侧链裂解形成孕烯醇酮，再经17-羟化并脱去侧链，形成睾酮，此过程中的关键酶有细胞色素胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3-羟类固醇脱氢酶(3-HSD)、17-羟化酶(CYP17)、17-羟类固醇脱氢酶(17-HSD)。目前研究发现，TBTC引起睾酮合成代谢过程中的关键酶的表达及活性改变，但结果不完全一致。Mcvey14等人发现,大鼠睾丸微粒体中CYP17的活性被59mmol/L的TBTC抑制了50以上，而对17-HSD的活性没有影响。12mmol/L的TBTC就

12、可使3-HSD的活性几乎完全丧失。将大鼠睾丸微粒体标本孵育在110000nmol/L脱氢表雄酮(作为底物)中，通过012mmol/L的TBTC进行动力学分析，发现TBT是3-HSD的主要的竞争性抑制物。而Ohno15等研究了有机锡化合物对猪睾丸中睾酮合成过程中有关酶活性的影响。体内实验发现，相对低浓度的三苯基锡(TPT)使得17-HSD(IC50=26mol/L)、CYP17(IC50=117mol/L)活性受抑制。然而，P450scc和3-HSD异构酶的敏感性较低，TBT又比TPT的作用弱。003mol/L TPT或01mol/L TBTC抑制猪睾丸间质细胞中雄烯二酮向睾酮的转化，提示这些有

13、机锡在体内和体外都抑制17-HSD的活性，体外TPT的半数致死浓度(IC50)=48nmol/L,TBT的IC50=114nmol/L。Nakanishi16等研究了17种锡化合物对人绒毛膜癌细胞中17-HSD I的催化活性和mRNA的表达，发现TBT增强了17-HSD I的mRNA的转录和酶活性，且呈剂量-反应关系。但TBT对17-HSD的活性影响的研究结果不一致，可能与动物种属和组织的不同有关。22对睾酮分解代谢的影响睾酮在其靶器官(如附睾和前列腺)内，被5-还原酶还原为双氢睾酮，再与靶细胞内的雄激素受体结合而发挥作用。睾酮也可以在芳香化酶作用下转变为雌二醇。血液中9799的睾酮与血浆蛋白

14、结合，只有13睾酮是游离的。睾酮主要在肝被灭活，以17-氧类固醇结合型由尿排出，少量经粪便排出。研究发现,TBTC使睾酮分解代谢过程的酶，如5还原酶，P450芳香化酶的活性减弱。5还原酶有2个同工酶，即I型和II型。Doering17等研究发现，5还原酶I型可被TBTC(IC50=199mmol/L)和DBT(IC50=329mmol/L)完全抑制，而5还原酶II型仅被TBTC(IC50=108mmol/L)抑制。TBT竞争性地抑制5还原酶I型，而不可逆地抑制II型同工酶。表明TBTC可抑制睾酮转化为活性更强的双氢睾酮。Saitoh18等检测了TBT对培养的人腺样瘤细胞系(KGN)中芳香化酶活

15、性的影响，发现1000ngml TBT引起细胞24h内死亡，而200ngml TBT引起细胞凋亡。20ngmlTBT(被认为是引起海洋生物性畸变的剂量水平)处理48h后，KGN细胞的增殖未受影响，而芳香化酶的活性被显著抑制。20ngml TBT作用7d后，由雄烯二酮转化来的雌二醇的量明显减少。提示TBT可抑制芳香化酶的活性，并降低KGN细胞中P450芳香化酶mRNA的转录水平。有研究发现,TBTC可增强哺乳动物细胞中雄激素受体(AR)介导的靶基因的转录。Yamabe19等用含荧光素酶报告基因的人前列腺癌细胞系LA16进行了研究，该报告基因是AR的靶基因，因此,LA16细胞在雄激素的作用下能够增

16、殖。发现100nmol/L TBT剂量组中，报告基因的转录增强。细胞增殖程度和1nmol/L双氢睾酮处理组一致。TBT也增强内源性AR的靶基因(如前列腺特异抗原)DNA的合成和表达，而AR本身的量并没有增加。然而，雄激素拮抗剂氟他米特并不抑制TBT的这一增强作用，且双氢睾酮更增强TBT的这一作用。说明TBT能激活哺乳动物细胞中AR介导的转录，并提示在这个激活作用中，除了配体结合位点还有一个新的靶位点。研究发现，TBTC对睾酮的分解代谢过程的影响不是单向的，其作用的环节不同，但TBTC的体内实验结果表明，睾酮分解代谢酶受抑制这一环节占主导因素，而TBTC对AR介导的转录增强作用很弱。3结语即使全世界停止使用有机锡涂料，其残留物对海洋生物的危害也会持续相当长时间，并通过食物链影响到哺乳动物及人类，其机制有待进一步研究。