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1、人CC10基因在肺腺癌A549细胞中的表达 CC10基因Expression of Human CC10 Genein Lung Adenocarcinoma A549 CellAbstract：ObjectiveTo construct and identity human the expression plasmid pcDNA3.1hCC10. MethodsA 273 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of normal lung tissue by RTPCR,then inserted it into express
2、ion vector pcDNA3.1 by DNA recombinant techniques . We transfected pcDNA3.1 hCC10 in A549 cells by liposomemediated gene transfer method. The protein expression of CC10 was detected by the techniques of immunofluorescence and Western blot. ResultsAfter the identification of restriction enzymes analy
3、sis and sequencing,the recombinant plasmidpcDNA3.1hCC10 was confirmed which contained the correct and entire nucleotide sequence of the CC10 DNA in pcDNA3.1. The expression of CC10 in protein level ascend in A549 cells transfected with reconstructive plasmid. ConclusionThe pcDNA3.1hCC10 expression p
4、lasmid was successfully constructed, acquired stably protein expression in A549 lung cancer cell line.Key words：CC10;Gene cloning;Gene expression摘要：目的构建及鉴定人CC10基因真核细胞表达载体。方法采用RTPCR法，从人肺组织的总RNA中扩增出273bp的人CC10 cDNA片段，利用DNA重组技术将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，脂质体法转染pcDNA3.1hCC10到肺腺癌A549细胞，荧光免疫细胞化学法及Western blot法
5、检测CC10蛋白的表达。结果用酶切重组质粒并行序列鉴定，人CC10基因已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，体外染pcDNA3.1hCC10的肺腺癌A549细胞中CC10蛋白表达明显增高。结论成功构建了CC10基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1hCC10，并获得表达。关键词：CC10;基因克隆;基因表达0引言CC10是肺clara细胞主要分泌蛋白。过去研究表明CC10与哮喘、慢性阻塞性肺病（COPD）等多种肺部炎性疾病的发生、发展有关1。近年来，CC10作为一种新型抑癌基因引起学者们广泛关注2。本实验构建CC10基因的真核表达载体，为下一步阐明CC10的抑癌机制提供有益的帮助。
6、1材料与方法1.1材料肺腺癌A549细胞及大肠杆菌DH5由本实验室保存。CC10多克隆抗体购于美国Biovendor公司，PGEMT.PCR产物回收试剂盒及Lipofection分别为promega、Takara及Invitrogen等公司产品，pcDNA3.1质粒由华中科技大学同济医学院生化实验室保存。1.2方法1.2.1总RNA提取取同济医科大学附属同济医院胸外科手术病人剥离的肺组织100g并剪碎，按RNA抽提试剂盒提取总RNA。1.2.2人CC10的cDNA合成以提取的总RNA为模板，加入随机引物oligo(dt)15(0.5mg/ml)、dNTP(10mmoL/L)各1l, DEPC处
7、理的无菌去离子水7l，70变性10min，随后在MMLV逆转录酶的作用下完成cDNA第一链的合成。以新合成的cDNA为模板，加入上游引物：5TACACAGTGAGCTTTGGGC3及下游引物：5ATGAAACTCGCTGTCACCC3，在PE480扩增仪上扩增，扩增参数为：9445s,551min,721min,循环35次， PCR产物用1.5%琼脂糖电泳。1.2.3人重组真核表达质粒pcDNA3.1hCC10的构建将PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1分别用Hind和BamH双酶切，琼脂糖电泳后回收、纯化后连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5。在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养过夜，随
8、机挑取单个菌落，摇菌培养，小提取试剂盒提取质粒DNA进行初筛。重组真核表达质粒pcDNA3.1hCC10的构建。1.2.4CC10 DNA序列测定用双酶切法分解扩增后的阳性重组质粒pcDNACC10，回收目的基因DNA，采用Sang双脱氧法行序列测定（上海博亚公司）。1.2.5基因转染A549肺腺癌细胞株接种于6孔培养板，在RPMI 1640培养基（含10%FCS），37，5%CO2的条件下行常规培养，细胞培养至70%，按试剂盒的步骤行脂质体转染，并设空质粒对照组及空白对照组。1.2.6细胞免疫荧光观察CC10蛋白质表达转染48h后，将转染的A549细胞爬片分别用40g/L多聚甲醛固定30mi
9、n，PBS洗涤3次。依次加入50l 1200 CC10一抗、二抗及1100鼠抗人IgGFcFITC荧光抗体100l，制片后立即于倒置荧光显微镜摄像。1.2.8Western blot法检测CC10蛋白质表达待各实验组中A549细胞生长至106个，加入适量预冷的三去污细胞裂解液，按常规的方法行细胞总蛋白提取，用紫外分光光度计测量蛋白浓度。上样每孔加入1015l样品胶后，10mA恒流下的丙烯酰胺凝胶电泳4h，其中浓缩胶及分离胶的浓度分别为4%、10%。电泳结束后行转膜及免疫杂交DAB显色反应。2结果2.1人CC10 DNA的制备RTPCR扩增后所获得的人CC10电泳产物位于 Markers的250
10、bp附近，见图1，与预期的273bp目的片段大小接近，表明扩增片段是我们所需的目的基因片段。2.2人CC10真核表达质粒的酶切鉴定用Hind 和BamH 双酶切对真核表达载体pcDNA3.1hCC10鉴定结果表明，获得预期大小(273bp)的DNA片段及5.4kbp大小的pcDNA3.1片段，见图2。2.3序列测定结果电泳回收的PCR产物经小提试剂盒抽提，纯化后用酶切分析方法对PCR产物进行测序。DNA序列分析证明与已报道的基因序列一致，其序列为：atgaaactcgctgtcaccctcaccctggtcacactggctctctgctgcagctccgcttct gcagagatctgcc
11、cgagctttcagcgtgtcatcgaaaccctcctcatggacacaccctcc agttatgaggctgccatggaacttttcagccctgatcaagacatgagggaggcaggggctcagctgaagaagctggtggacaccctcccccaaaagcccagagaaagcatcattaagctc atggaaaaaatagcccaaagctcactgtgtaat2.4转染真核表达质粒后A549细胞CC10蛋白的表达免疫荧光染色可观察到在未行转染的A549细胞浆中有少量的阳性物质表达，胞核则未见绿色荧光，见图3a；而转染hCC10基因的A549细胞浆中绿色荧光阳性物质表达明显增加，部分胞核亦可见绿色荧光。结果表明CC10蛋白在胞浆及胞核均有表达，其中以胞浆为主，见图3b。
人CC10基因在肺腺癌A549细胞中的表达
