鼠单克隆抗体人源化

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1、细胞与分子免疫学杂志1997;13(1):68-72Journal of Cellular and Molecular Immunology鼠单克隆抗体人源化袁清安俞炜源黄翠芬(军事医学科学院生物工程研究所，北京100071)提要 鼠源性单克隆抗体应用于临床由于HAMA反应的存在而受到阻碍。以CDR 移植为核心，以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服HAMA 反应的主要手段。本文结合单克隆抗体人源化的最新进展对该领域的工作作一综 述。关键词人源化CDR移植分子模建HAMA单克隆抗体抗体是免疫系统中最重要的分子,在临床上有极大的应用价值。其立体结构组成 与功能关系表明，不同的结构

2、模块(CH1、CH2、CH3、V、V)在空间和折叠上相对 独立，对应着不同的功能。抗体的效应功能由Fc引发；特异性和高亲和性由Fv 决定。大量的抗体一级结构序列和越来越多的抗体立体结构数据分析表明,Fv在 空间结构上十分保守，但人、鼠间有差异的框架区(FR)、空间构象及序列各由有 差别的6个互补决定区(CDR)组成。CDR上有直接的抗原接触位点,FR是Fv最主 要的抗原性决定区，是引起人抗鼠抗体(HAMA )反应的主要部分，在异种间可引起 抗个体型抗体。1鼠源单克隆抗体的临床应用与问题以细胞融合为基础的鼠杂交瘤技术的发展，使得人们能够大量获取高亲和性和强 特异性的鼠单克隆抗体(McAb),它们

3、在临床上有多方面的潜在应用1。1.1感染性疾病抗体提供的被动免疫，消除了病原体的致病能力：仅仅是Fab 与抗原的结合，足以中和很多毒素与病毒的毒力；Fc与相应受体结合，可引发包 括ADCC在内的诸多效应功能。1.2体内定位诊断同位素标记的McAb或Fab在病灶的定位造影，对确诊及手术 有很大帮助，已用于心血管、原发癌及转移癌等疾病的定位诊断。1.3免疫调节在免疫活化方面,双特异性的抗体将效应细胞表面的信号转导分 子和病变细胞表面的抗原分子交联，便可活化效应细胞，使之发挥免疫功能;在免 疫抑制方面，抗受体抗体可封闭受体，阻断效应细胞活化的路径。因受体分子的分 布而引起普遍性的或选择性的免疫抑制，

4、在移植排斥和自身免疫等疾病的治疗上 有广阔的前景。1.4肿瘤治疗 肿瘤特异抗原或相关抗原的抗体可作为导向分子，将效应细胞（如 Tc）和免疫活化因子（如IL-2）富集于肿瘤组织周围，发挥它们的杀伤作用;小分子 抗体导向的免疫毒素可渗透到实体肿瘤中，对癌细胞进行有效杀伤；自分泌生长 型的肿瘤可用抗生长因子抗体或抗受体抗体进行竞争抑制，减缓肿瘤的生长。McAb在临床上还有其他方面的应用，有待于进一步的开发。其中很有意义的是血 栓病的治疗。将抗血小板抗体或抗纤维蛋白抗体与溶栓活性分子偶联或融合，作 成用量少、见效快的新型溶栓导向药物，已有多种应用于临床试验。不幸的是McAb应用于人体存在着严重的缺陷:

5、血清中半寿期短;仅有部分不同 亚类的抗体能引发效应功能;最大的障碍是诱发HAMA反应。McAb诱导的内源性 抗体基本上可分两类1：抗个体型（anti-idiotype）和抗同种型（anti-isotype）。 前者通过中和抗原结合位点而消除了 McAb的能力；后者除了加速McAb的清除外, 还会在诊断时引起假阳性，还可能引起过敏性休克。除非这些问题被解决,大剂量 及多次给病人使用McAb是不可能的。目前克服这一困难的首选途径是鼠McAb 的人源化。2鼠McAb人源化的原则和策略使用人源抗体或人源化抗体是克服HAMA反应的两种可能的方法。由于特异性强、 亲和力高的人源抗体的基因不易得到，目前主要

6、进行鼠McAb的人源化。鼠McAb 的人源化，就是为克服鼠源McAb的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗 体分子具有极其相似的轮廓（profile）,从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导 HAMA反应。进行抗体的人源化有两个基本原则:保持或提高抗体的亲和力和特异 性;大大降低或基本消除抗体的免疫原性。人源化有多种方案，都必须遵循这两个 原则，尤其不能丧失抗体特异结合的能力。第一代人源化抗体是将鼠McAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体。由于 这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗原亲和力保持得很好，但因为有鼠 McAb可变区的存在，应用时仍有强烈的HAMA反应。在此基础上，进一步将鼠

7、McAb可变区中相对保守的FR换成人的FR,仅仅保留抗 原结合部位CDR（即CDR移植），这才是真正意义上的抗体人源化。但起脚手架作 用的FR不仅提供了 CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形 成,甚至参加与抗原的结合。因此，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体 的亲和力。如何在FR中、FR和CDR之间进行操作，目前有几种策略。2.1模板替换使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR5。在选择人FR时一般有两条途径。最初人们采用的一条途径是，对需要进行人 源化的鼠McAb采用同一个（或少数几个）人源FR进行替换。已有晶体结构数据的 人源抗体的可变区框架（Vh如NEW,K

8、OL;Vl如REI等）用作替换的基本模板，借助序 列比较与分子模建确定在人、鼠间有种源差异，尤其是鼠FR中与CDR有密切作用 的氨基酸残基，保留在替换的人源FR中。为了保持CDR的空间构象，要特别注意 原来抗体的CDR下面的堆积残基，以及CDR周围的残基。该途径的优点在于，确 切的人源FR晶体结构为残基替换提供了较明确的信息，可排除很多盲目性;不足 在于不易保持鼠CDR的天然构象，很可能降低或丧失抗体的亲和力。此外，要改 变的氨基酸残基太多，降低了成功率。第二条途径是，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠McAb FR有最大同源性的人源 FR用以替换。在选择同源的人FR时,先前的工作者倡导将V和V作为

9、一个整 体来考虑，寻找最高同源的人FR。其理由是同一个抗体的V和V在折叠上更能匹 配。以后的工作者则认为,将V和V分开考虑，分别寻找最高同源的对应序列， 更好地保持FR原来的框架，在整体上给鼠CDR提供最类似的环境。两种方法均有 成功的实验报道。总之，同源替换主要考虑的是，鼠CDR在此背景下有类似的折 叠环境，从而可保持原来的构象。同样需要分子模建来提供CDR移植后可能或缺 的FR关键残基的信息。同源替换的优点是，能减少需要更改的氨基酸数目，更好 地保持CDR需要的空间环境;不足的是选择的人源FR可能并无结构数据,不能提 供有效的关键残基信息。2.2表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基进行镶饰(

10、veneering)或重塑 (resurfacing),以使之类似于人抗体CDR的轮廓(profile)或人FR的型式 (pattern)。表面重塑途径的一个前提是，鼠McAb可变区的免疫原性起源于它的表面残基。 因为现在普遍认为，残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条 件，因此表面残基理应携带绝大部分(如果不是全部)的抗原表位。溶液可及性表 面残基的划分标准是，构成该残基的全部原子的30%以上是溶剂可及的。尽管人、 鼠间抗体可变区表面暴露残基的精确型式有差别，但大多数的表面位置的残基类 别有强烈的倾向性，仅仅考虑这种表面型式就可分出抗体可变区的组别。这说明 抗体可变区表面至少也

11、和框架区核心一样保守，表面型式的差别是人鼠间抗体的 主要差别10。根据对现有的抗体品体结构数据的分析结果统计，在序列配对位置 上，人、鼠间抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98%。这说明在 异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶液可及表面残基引起的。将鼠 特异性表面残基换成人源性的，就可模拟人源抗体的表面轮廓，逃避人体免疫系 统的识别，达到人源化的目的。该策略可以不进行同源模建，在序列同源分析的基 础上，选择与鼠表面残基暴露类型最相匹配的人源型式进行，但不够准确。另外， 如果要改变的残基在侧链大小、电荷、疏水性，或有可能形成氢键从而影响到CDR 的构象，则不予改变。因为要改变的

12、残基较少,能减少CDR-FR之间的不相容性。该策略作为较新的一种人源化途径，还在逐步成熟阶段。鼠源McAb在人体引起的 HAMA反应，究竟是完全由其表面的暴露残基引起，还是由表面残基与内部残基的 共同贡献，涉及到抗体产生最基本的免疫学机制，而这种机制仍是目前探讨的热 点。尽管有人认为口口，即使在MHC背景下鼠源McAb被加工和提呈后包埋残基暴 露出抗原性，但诱生的抗抗体也只能和降解的或解折叠的原抗体起反应,不会十 扰原抗体的治疗效应。2.3补偿变换 在人FR选择与CDR有相互作用、与抗体的亲和力有密切关系或对 FR空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植冒。立体结构数据和同

13、源性分析表明:在抗原结合、稳定CDR构象、FR折叠(内部堆 积)这几个方面而言，构成抗体FR的残基并不具有相同的重要性。以此为依据将 这些残基分成3类口口 ：低风险性 (low-risk)残基，即暴露于溶剂而对抗原结合和 抗体结构贡献甚少的残基。替代这些位置的残基能降低免疫原性而几乎不影响抗 体的亲和力；高风险性(high-risk)残基，即直接参与抗原结合、稳定CDR构象或 FR折叠的残基。为了保持人源化抗体的活性,应尽量避免在这些位置进行替换。 对中度风险tt(moderate-risk)残基应谨慎从事。FR中的高风险性残基和某些中 度风险性残基，通称为ECDR区补充调控残基(non-CD

14、R complementarity modulating residues)。它们散布于线性序列的不同位置,为每个CDR回折(loop) 提供了合适的平台。其形状和侧链大小协同决定CDR的基本构象，并影响其抗 原结合的特异性。因而将CDR搬到人源FR后,必须将人FR中的这些位置替换成 鼠源非CDR区补充调控残基以补偿完全的CDR移植。这种分析方法使人源化突变 方案具有选择性和针对性，避免了盲目的可能导致失败的探索。通过在中度风险 性残基中进行变化，还有可能提高人源化抗体的亲和力。不足的是对残基的分类 要以晶体数据和三维结构为基础，才能提供准确的标准。2.4 定位保留(positional co

15、nsensus method)区 人源化 McAb 保留了 鼠源 McAb 可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基。尽管鼠 框架区的其余部分可以从某个人FR中搬移过来，毫无疑问，这样得到的人源化抗 体序列和人抗体的保守序列(consensus sequences)在一些位置上有差别。这些 来源于个体型抗体亲和力成熟过程中体细胞突变的非典型残基，应用于病人后会 诱导免疫反应。因此，理想的途径是，以人FR保守序列为模板进行人源化。由 于人抗体轻、重链可变区不同亚类的保守序列并不相同，需要一种合适的方法来 寻找最适保守序列。最简位置模板(minimal positiona

16、l template)表明，抗体 可变区中哪些位置绝对需要保持抗体的抗原结合结构域的完整性，提供了确定关 键位置的方法。在选择人框架区时，首先从现有的人源抗体保守序列中搜寻与鼠框架区最类似的 序列;其次根据最简位置模板确定鼠可变区的关键位置残基;最后保留所有这些位 置而将其余部分进行人源化。Couto等W首先利用计算机模建和实验探索找到 一个最简模板。以此模板对抗乳腺表皮抗原BA46的抗体Mc3成功地进行了人源 化。以上所述人源化的四种策略均以保持抗体的亲和力为核心，以降低免疫原性为目 标,各有特点。总之，抗体人源化设计的关键步骤是：(1)从同源抗体中或共同序列 抗体中选择人源FR;根据已发表

17、的信息，确定FR中起关键作用的氨基酸；(3) 以鼠McAb可变区立体模型作指导。在设计过程中，同源分析和分子模建提供了必 需的辅助手段。虽有一些一般性原则，但对某一具体的鼠McAb进行人源化时则必 须具体分析。一个共同的问题是，选择何种亚类抗体进行人源化。一般地，如果以临床治疗应 用为主，则选择IgG1或IgG3,因为它们的血清半寿期长,Fc结合能力和补体固定 及ADCC性质较好;如果是用来进行受体封闭或用作导向分子，则以不太活泼的 IgG2为佳。3人源化抗体的评价除鼠源CDR夕卜，人源化抗体的免疫原性还依赖于其它几个因素，包括病人的免疫 状态,使用抗体的剂量和给药方式。抗膜抗原的抗体的免疫原

18、性可能比抗可溶性 抗原的抗体的免疫原性要强，因为前者结合于膜上更易被吞噬、加工并提呈给免 疫细胞。另外，即使是人源FR,相对于胚系片段（germ-line segments）的突变也 可能具有免疫原性。对于人源化抗体的免疫原性,可以从3个层次进行评价:首先, 通过将人源化抗体的可变区序列与人抗体库中最高同源性的抗体可变区序列进 行比较，以及整条重链或轻链进行比较，两者（尤其是前者）相似性越高则人源化 （就降低免疫原性而言）越可能成功。其次，通过同源模建获得人源化抗体的三维 结构，在CDR周围0.5 nm范围内，FR中可能与CDR相互作用的残基，检查这些相 互作用是否会引起CDR的构象变化（与天

19、然构象有异）。若有，则可能导致抗体亲 和力降低。第三，直接测定人源化抗体的亲和力，与鼠源亲本抗体作比较,准确评 价亲和力的变化。一种基于生物传感器的分析系统15biosensor-based analytical system）可用于抗原-抗体相互作用的动力学分析和亲和力计算。附表CDR移植抗体及其潜在临床应用免疫原性检测的首选动物模型是恒河猴（Rhesus monkey）。人源化抗体体外处理 的器官移植于病人后的免疫反应，以及在志愿者（病人）同意的情况下体内使用人 源化抗体,都能提供最直接的评价数据。附表是一些已经或正在被研究的CDR移 植抗体。4结语作为抗体工程的最前沿，抗体人源化仍有许多

20、疑点，探索的空间很大。基本的问题 是免疫原性产生的机制未有定论，主要的限制是特定抗体的晶体结构数据不易立 即获得，突变的残基较多,需要多次摸索。评价时动物模型成本高也是一个困难。 尽管如此,人源化的OKT3（抗-CD3）,CAMPATH-1-H（抗-CDw52）,anti-Tac等都已进 入临床试验或批准使用，为新药开发和一些顽疾的治疗展示了人源化抗体的美好 前景。参考文献1 Bach JF,et al.Immunol Today 1993;14（9）:4212 Winter G,et al.Immunol Today 1993;14（6）:2433 Ohtomo T,et al.Mol Im

21、munol 1995;32(6):4074 Ralph-Rapley Mol Biotech 1995;3:1395 Singer II,et al. J Immunol 1993;150:28446 Jolliffe LK.Int Rev Immunol 1993;10:2417 Co MS,et al. J Immunol 1994;152:29688 Kolbinger F,et al.Protein Eng 1993;6(8):9719 Rogska MA,et al.Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:96910 Pedersen JT,et al.J Mol Biol 1994;235(3):95911 Studnicka GM,et al.Protein Eng 1995;7(6):80512 Marie-Alix Poul,et al.Mol Immunol 1995;32(2):10113 Couto JR,et al.Cancer Res 1995;55(23 Suppl):S597314 Couto JR,et al.Cancer Res 1995;55(8):171715 Malmqvist M.Nature 1993;361:186(收稿 1996-07-02 修回 1996-10-30)作者简介：袁清安，男，28岁，博士生