美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的改善作用及其机制研究药学专业

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1、目 录摘 要1关键词1Abstract1Key words2第一章 绪论21.1 研究背景21.2 研究的目的及意义31.3 在临床药物治疗中的发展趋势3第二章 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎改善作用的观察42.1 实验材料42.1.1 实验动物42.1.2 实验药品42.1.3 实验仪器42.2 实验方法42.2.1 分组、造模方法及给药方法42.2.2 标本采集52.2.3 观察指标5第三章 美沙拉嗪联合龟龙丸改善结UC大鼠结肠炎的机制研究63.1 实验材料63.1.1 实验动物63.1.2 实验药品63.1.3 实验仪器63.2 实验方法63.2.1 分组、造模方法及给药方法63.3

2、.2 标本采集73.2.3 观察指标7第四章 美沙拉嗪联合龟龙丸的临床药物试验观察84.1临床资料84.2治疗方法84.3观察指标94.4疗效标准9第五章 可行性论证9第六章 预期结果及分析96.1 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎改善作用的观察96.2 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎机制的研究106.3美沙拉嗪联合龟龙丸的临床药物试验观察11参考文献11致谢13美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的改善作用及其机制研究、 摘 要：目的是分析美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的改善作用和机制研究。方法是，运用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)与乙醇法诱导溃疡性结肠炎大鼠模

3、型。将70只大鼠分为七组对照组，当然为了实验的准确，采用的是随机分配，结肠炎模型组，美沙拉嗪组，龟龙丸组，美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、高剂量组。通过观察七组大鼠结肠炎粘膜完整性、测定大鼠血清IL-4和IL-6的浓度以及各项指数反映出美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的改善作用，并且通过检测各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、NF-B蛋白表达水平、检测各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、TNF-、NF-B m RNA水平以及对各组大鼠血清中相关炎症因子以及粪便样品中FC水平检测来探究美沙拉嗪联合龟龙丸治疗溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的机制。并最终将动物实验验证有效的美沙拉嗪+

4、龟龙丸联合治疗方案进行临床验证，从而说明龟龙丸及联合用药方案的优势及有效性。 关键词：美沙拉嗪；龟龙丸；溃疡性结肠炎；TNBS与乙醇诱导法；TLR4；TRAF6；NF-BEffect and Mechanism of Melaxazine Combined with Guilong Pill on Colitis in Ulcerative Colitis Rats(College of Pharmacy Engineering, Jishou University, Jishou Hunan, 416000) Abstract: Objective to study the effect a

5、nd mechanism of mesalazine combined with guilolong pills on colitis in rats with ulcerative colitis. Methods: the rats model of ulcerative colitis was induced by TNBS and ethanol. Seventy rats were randomly divided into control group, colitis model group, mesalazine group, Guilong pill group, mesala

6、zine group, low dose group, middle dose group and high dose group. The improvement of mesalazine and Guilong Pill on colitis in rats was observed by observing the mucosal integrity of colitis in seven groups, the concentration of IL-4 and IL-6 in serum of rats and the indexes. The improvement of TLR

7、4, TRAF6, NF in the colon tissue of rats in each group was detected- The expression level of B protein, TLR4, TRAF6 and TNF in colon tissue of rats in each group were detected-、NF-The level of B M RNA and the level of FC in serum of rats were measured to explore the mechanism of mesalazine combined

8、with Guilong pill in the treatment of colitis in rats with ulcerative colitis. Finally, the combination of mesalazine and Guilong pill, which was proved to be effective in animal experiments, was verified in clinical practice, so as to illustrate the advantages and effectiveness of Guilong pill and

9、its combination.Key words: mesalazine;Guilong Wan; Ulcerative Colitis; TNBS and ethanol induction; TLR4；TRAF6；NF-B 第一章 绪论1.1 研究背景溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种较为复杂的疾病，是一种常见消化系统疑难杂症，治愈率低并且易复发，且目前在全球发病率逐年上升。其在临床上表现为慢性腹泻或亚急性腹泻，粘液脓血便及腹泻等。会严重降低患者的肠胃功能并影响患者的生活质量。环境因素，遗传因素以及肠道微因素都会导致免疫失衡，从而引起溃疡性结肠炎。但目前尚未

10、研制出特效药，难以治愈。目前针对溃疡性结肠炎的主要治疗方式包括药物治疗、手术治疗和基因治疗等治疗方式。现代临床治疗溃疡性结肠炎的药物主要包括：氨基水杨酸类药物，提到治疗UC，该类药物是首先被选择使用的，然而使用该类药物时，如果剂量不当，很容易会发生不良反应；糖皮质激素：该类药物有90%的治疗有效率，虽然有效率不等于治愈率，但是对于UC近期疗效十分显著，尤其是处于急性活动期时，但该类药物并不能控制UC的复发；免疫抑制剂：主要就是指 6巯基嘌呤，当然还有硫唑嘌呤。不过硫唑嘌呤这种物质，很容易就会产生像中性粒细胞减少，或者肝脏毒性这种反应，甚至还有可能导致胰腺炎等多种不良后果1,在临床治疗过程中，该

11、类常和水杨酸类药物混合使用，使用不当可能会导致骨髓抑制的加重；生物制剂: 经常使用的是英夫利昔，不过抗CD3单抗也必不可少。相比后者，使用前者可能会产生比较多的不良反应，主要体现为血液中各种细胞的减少，包括白细胞这种免疫细胞，还有中性粒细胞，当然全血细胞也在其中。虽然抗CD单抗相比前者，产生的不良反应会有所减少，但这并不意味着完全没有，也会有恶心，甚至发热，服用后患者体内的一过性 T 细胞也会减少2。抗菌药物: 主要是抗厌氧菌药物以及广谱抗生素。通过许多学者的不断研究，我们终于发现了有效治疗UC的关键在于甲硝唑 ，然而，这并不意味着，UC可以被治愈，患者长期服用也会产生相关的问题，更别说类似孕

12、妇这种特殊人群，安全性仍旧有待提高3; 微生态制剂，该类药物对UC的治疗有益，然而在临床治疗过程中，如果仅仅单独使用益生菌制剂，那么治疗 UC 的效果就不是很明显，所以这种药物在使用过程中经常和其它类药物配合使用。所以，针对目前这种现状，如果想采取药物来治疗UC，那么这个治疗方法还需要我们更加深入的研究。除药物治疗外，也可以通过手术的方式治疗UC：不过这种方法，主要用于UC不断发展甚至出现了十分严重，可能致死的并发症，还有就是UC自身产生癌变或者医生怀疑癌变，保守治疗也就是药物治疗很难控制情况的时候，并发症主要有大出血，还有穿孔，甚至还可能出现中毒性巨结肠4。针对该病的常规西医治疗方法，往往具

13、有一定的副作用，患者难以坚持长期用药，只能短期控制，易复发，总体疗效并不理想。而土家医学对于此类疾病有着不同的研究，因此可以尝试在传统西医治疗的基础上，联合土家医学方法，采取传统医学与土家医学结合的原则，能够达到更为理想的治疗效果。在目前所有的研究中，只要是针对疾病机制的,都认为建立良好的肠道炎症动物模型这个行为具有十分重要的作用和意义，尤其是对于研究UC发病机制，还有就是美沙拉嗪联合龟龙丸的疗效。现在的研究中，学者经常使用TNBS/乙醇法，从而能够使得大鼠体内的免疫与炎症反应，以此来建立溃疡性结肠炎动物模型,这个实验虽然是人为的且建立在鼠类身上，但是病理表现和人类的UC是差不多的。Toll样

14、受体4(TLR4）/核因子B(NF-B）信号通路被认为是促进炎症因子释放的重要途径，当该通路被激活时，促炎因子如肿瘤坏死因子（TNF-）和白细胞介素1(IL-1）等得以表达，并参与相关的过程，主要是机体炎症反应，还有免疫应答。李姿慧5等研究证实，参苓白术散对于UC模型大鼠NF-B相关蛋白的表达，是存在一定的抑制作用的，下调血清TNF-、IL-6及IL-1的表达水平，从而对大鼠的结肠黏膜起到保护作用，说明NF-B信号通路与UC的炎症反应密切相关。通过此次研究，我们可以看出，在成功的进行TNBS造模之后,在结肠炎模型组中，大鼠活动状况明显减弱，甚至体质量也降低了很多，并且结肠组织出现明显损伤，这些

15、状况都很符合UC临床表现。本设计通过对UC大鼠的研究，明确大鼠结肠炎的发生机制以及美沙拉嗪联合龟龙丸对炎症的改善作用。对药物临床研究也有较为重大的意义。1.2 研究的目的及意义 通过制作SD大鼠实验模型，分组观察美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎的改善作用，找出其发病机制及原因，并将动物实验验证有效的美沙拉嗪+龟龙丸联合治疗方案进行临床验证，对龟龙丸及联合用药方案的优势及有效性其进行分析，而且还对于研究的现状以及这项研究的未来发展进行思考与期盼。1.3 在临床药物治疗中的发展趋势研究表明，免疫系统紊乱以及氧化应激都参与了溃疡性结肠炎的发展，这些发病机制的关键环节为新药的研究提供了思路。

16、溃疡性结肠炎的一线治疗药物主要有氨基水杨酸抑制剂，还包括糖皮质激素类药物。美拉沙嗪属于5-氨基水杨酸类药物，美沙拉嗪能够有很好的抑制效果，尤其是对于肠壁的炎症，美沙拉嗪口服后，大部分药品可进入回肠，在炎症粘膜上发生作用，从而对于炎症介质白三烯的形成能够形成抑制、抑制引起炎症的前列腺素的合成。通过抑制这两种化学物质的形成，起到对肠壁炎症位置的消炎作用，但是，单用美沙拉嗪这一种药物治疗溃疡性结肠炎的效果不明显，极其容易复发，而且如若大量使用会出现严重的不良反应。龟龙丸是用土家族药物制成的蜜丸，是用水黄连、山乌龟、水龙骨等十位中草药组成。其对溃疡性结肠炎有明显的改善作用。所以，在应用美沙拉嗪治治疗溃

17、疡性结肠炎的同时，联合龟龙丸，治疗效果理想，不良反应少。第二章 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎改善作用的观察2.1 实验材料2.1.1 实验动物SPF级SD大鼠140只,雌雄各半,体重(20020)g。2.1.2 实验药品5%的2,4,6-三硝基苯磺酸;葡聚糖硫酸钠；美沙拉嗪缓释颗粒剂;龟龙丸；10%水合氯醛。2.1.3 实验仪器TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、石蜡切片机、摊片机、生物组织包埋机、生物荧光显微镜、大鼠白介素IL-4和IL-6的ELISA试剂盒、4高速离心机、分光光度检测仪器、体重计、天平, 生物显微镜等。2.2 实验方法2.2.1 分组、造模方法及给药方法模型1：使用TNBS

18、/乙醇法，从而能够使得大鼠体内的免疫与炎症反应，以此来建立溃疡性结肠炎动物模型，对照组是必须的，其次还应该有结肠炎模型组，那么相应的美沙拉嗪组也必不可少，龟龙丸组、美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、还有高剂量组,每一个小组都有十只大鼠，在成立模型前，每只老鼠都要禁止吃任何东西一天。随后对它们进行麻醉，麻醉剂是10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g),接下来就要使用聚丙烯管插入它们的肛门，注意动作一定要轻轻的，不然很容易造成伤害，深度约8 cm，然后就用已经配好的TNBS/乙醇混合溶剂(100 mg/kg)慢慢地注入管中，接着就需要捏紧它们的肛门，大概五分钟，这是用化学法来对大鼠身体进行

19、诱导，使它们产生急性UC。七天之后，抽取2只大鼠，对它们进行解剖，并细心观察，不过注意要保持随机性，那么我们就可以看出，在这两只大鼠的病理结果中，已经有小溃疡面形成、还出现了充血水肿、炎性细胞浸润这些现象，这就表明之前的造模是成功的。那么在24h过后，我们还要进行分组，并对它们灌胃来治疗UC，前面两组，也就是对照组还有结肠炎模型组注射0.9%生理盐水,美沙拉嗪组给予100mg/kg灌胃治疗，龟龙丸组给予100mg/kg灌胃治疗，而美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予美沙拉嗪和龟龙丸(100、120、150 mg/kg)灌胃治疗。模型2：采用硫酸葡聚糖（DSS）诱导形成UC大鼠

20、模型。对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、龟龙丸组、美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只,大鼠饥饿12 h后(断食不断水),恢复正常饮食,对照组大鼠继续正常饮水,其余大鼠给予5.0% (w/v) DSS无菌水溶液,自由饮水连续5 d建立UC模型。第6天,大鼠体重明显下降,腹泻、大便出血明显。停止DSS饮水,给予大鼠正常自由饮水,对照组、结肠炎模型组给予0.9%生理盐水,美沙拉嗪组给予100mg/kg灌胃治疗，龟龙丸组给予100mg/kg灌胃治疗，而美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、还有高剂量组，每个组都进行灌胃治疗，药物都是美沙拉嗪和龟龙丸，不过浓度不同，分别是100、

21、120、150 mg/kg。2.2.2 标本采集每天都需要对大鼠进行观察，还要记录情况,甚至也要开展疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评分。治疗两周后，注意一定不能间断，要持续治疗，对大鼠再次进行禁食，依旧是24h，这之后在进行一系列的过程，比如给大鼠称量体重，再次麻醉，然后处死。对大鼠的尸体进行解剖，并在显微镜下观察，尤其是结肠病变情况，还要按照标准和自己的判断进行结肠粘膜损伤指数(Colon Mucosal Damage Index,CMDI)评分;然后再取结肠病变部位，放于4%多聚甲醛溶液，这样可以达到固定的目的,之后就是脱水，使组织透明化,还要通过一系

22、列的处理，不仅要石蜡包埋，还要组织切片，以及进行HE染色，最后封片,这才能放置于生物倒置显微镜下，来观察组织的病理变化，比如是否有溃疡面，还有结肠绒毛排列情况，当然充血及炎症细胞浸润也必不可少,还要检测结肠上皮厚度,再次按照标准进行组织学损伤指数(Tissue Damage Index,TDI)评分。2.2.3 观察指标1) 一般情况观察每天称大鼠体质量，不仅要观察大鼠一般状态，也要看大便形状是否有变化。2）疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评分在给予药物治疗后的第0天，4天后，一周后和两周后分别进行DAI评分，每只大鼠的DAI分值都要进行统计计算，并评估它们

23、的疾病活动情况。3）脏器指数测定使大鼠死亡之后，对它们进行解剖，用工具取出肝、脾和结肠，并且还要用生理盐水洗涤这些器官，直至干净，然后再吸干这些器官的表面水分，最好使用滤纸，这以后再进行称重，计算脏器指数：脏器（肝、脾、结肠）指数（mg/g）=脏器湿质量（mg）/体质量（g）6。4) 结肠黏膜损伤情况评定取结肠，并用工具沿着肠系膜剪开，再用冰生理盐水洗净内容物，注意一定是冰的，这样才能保证实验结果的准确，然后把它平铺开，最好在白色瓷板上，量取结肠长度和宽度，并按照文献标准的方法来进行结肠黏膜损伤（Colonmucosa damage index,CMDI）评分。5)血清中IL-4、IL-6水平

24、测定将血清从-20冰箱中取出放入4冰箱中，放置24h，让血清能够溶解，在实验前1 h取出来，放入正常室内就可以，等待全部溶解, 溶解后再轻轻摇晃混匀，注意动作幅度不要过大，也不能太小，否则混合不匀，有可能还有沉淀的出现。这之后严格按照使用说明书来操作，就是在大鼠IL-4和IL-6酶联免疫分析试剂盒上的说明。待以上所有操作全部完成之后，用自动化酶标仪分光光度计测定450 nm处的吸光度值 (OD值) 分别计算血清IL-4和IL-6的浓度。第三章 美沙拉嗪联合龟龙丸改善结UC大鼠结肠炎的机制研究3.1 实验材料3.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠70只,雌雄各半,体重(20020)g。3.1.2

25、 实验药品 5%的2,4,6-三硝基苯磺酸;美沙拉嗪缓释颗粒剂;龟龙丸；10%水合氯醛。Takara反转录试剂；Triquick Reagent总RNA提取试剂、高效RIPA组织/细胞裂解液、蛋白酶抑制剂混合液（100PIC）（批号P6730）、脱脂奶粉、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（TBST）、BCA蛋白浓度测定试剂盒；Trans Script-Uni一步g DNA拆卸和c DNA合成超混合液；兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体；大鼠免疫球蛋白G(Ig G）二抗、完全弗式佐剂；超敏型化学发光（ECL）试剂；0.9%氯化钠注射液（规格500 m L；作生理盐水用）；小鼠抗大鼠TL

26、R4一抗；兔抗大鼠NF-B p65一抗；兔抗小鼠TRAF6一抗；大鼠IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）分析试剂盒、大鼠FC ELISA分析试剂盒；大鼠TNF-ELISA分析试剂盒，辣根过氧化酶标记的兔二抗hnology；3.1.3 实验仪器 T18型组织匀浆机、TU-100C型恒温金属浴锅、单道移液器和5418R型低温离心机、一次性使用真空采血管、配套蛋白转印模块（湿转）及Power Pac Basic型电泳仪、TD4型普通离心机、DW-86L728J型医用低温保存箱、FC-1100型超微量核酸检测仪、G8830-64001型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪、50I型生物显微镜、Ta

27、non-5200型凝胶成像仪、HED-SY96S型酶标仪。3.2 实验方法3.2.1 分组、造模方法及给药方法模型1：使用TNBS/乙醇法，从而能够使得大鼠体内的免疫与炎症反应，以此来建立溃疡性结肠炎动物模型，对照组是必须的，其次还应该有结肠炎模型组，那么相应的美沙拉嗪组也必不可少，龟龙丸组、美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、还有高剂量组,每一个小组都有十只大鼠，在成立模型前，每只老鼠都要禁止吃任何东西一天。随后对它们进行麻醉，麻醉剂是10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g),接下来就要使用聚丙烯管插入它们的肛门，注意动作一定要轻轻的，不然很容易造成伤害，深度约8 cm，然后就用已经配

28、好的TNBS/乙醇混合溶剂(100 mg/kg)慢慢地注入管中，接着就需要捏紧它们的肛门，大概五分钟，这是用化学法来对大鼠身体进行诱导，使它们产生急性UC。七天之后，抽取2只大鼠，对它们进行解剖，并细心观察，不过注意要保持随机性，那么我们就可以看出，在这两只大鼠的病理结果中，已经有小溃疡面形成、还出现了充血水肿、炎性细胞浸润这些现象，这就表明之前的造模是成功的。那么在24h过后，我们还要进行分组，并对它们灌胃来治疗UC，前面两组，也就是对照组还有结肠炎模型组注射0.9%生理盐水,美沙拉嗪组给予100mg/kg灌胃治疗，龟龙丸组给予100mg/kg灌胃治疗，而美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组

29、、高剂量组分别给予美沙拉嗪和龟龙丸(100、120、150 mg/kg)灌胃治疗。模型2：采用硫酸葡聚糖（DSS）诱导形成UC大鼠模型。对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、龟龙丸组、美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只,大鼠饥饿12 h后(断食不断水),恢复正常饮食,对照组大鼠继续正常饮水,其余大鼠给予5.0% (w/v) DSS无菌水溶液,自由饮水连续5 d建立UC模型。第6天,大鼠体重明显下降,腹泻、大便出血明显。停止DSS饮水,给予大鼠正常自由饮水,对照组、结肠炎模型组给予0.9%生理盐水,美沙拉嗪组给予100mg/kg灌胃治疗，龟龙丸组给予100mg/kg灌胃治疗，

30、而美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、还有高剂量组，每个组都进行灌胃治疗，药物都是美沙拉嗪和龟龙丸，不过浓度不同，分别是100、120、150 mg/kg。3.3.2 标本采集末次给药之后，所有样本均禁止摄入任何东西，但可以饮水，时间长达24h，这之后，在它们的腹腔用10%水合氯醛溶液注入，这是对它们进行麻醉，立即剖腹取腹主动脉血约8 m L，静置30 min，以3 000 r/min离心15 min分离上层血清，置于-20冰箱内保存，待测。统一在距大鼠肛门约7 cm处取结肠组织后并置于4%多聚甲醛溶液中密封，置于4下避光保存，待测。取肠道内粪便样品适量，置于-20冰箱中保持，待测7。3.2

31、.3 观察指标1)各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、NF-B蛋白表达水平检测。采用Western blotting法。取“2.2”项下各组大鼠结肠组织40 mg，放入2 m L离心管，按照RIPA裂解液说明书上的方法，进行操作，并能够提取相关蛋白，匀浆至无沉淀，以12 000 r/min离心5 min，取出上清液，还要采用BCA法，这样对蛋白含量进行测量并定量至2g/L。蛋白于100变性10 min，对于变形后的蛋白，我们对它还要进行分离，用的是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用8%脱脂奶粉室温封闭3 h。相应一抗TLR4（稀

32、释度为12 000）、TRAF6（稀释度为12 000）、NF-B（稀释度为12 000）、GAPDH（稀释度为12 000)被加进来,37孵育12 h；以TBST洗膜15 min3次，Ig G二抗（稀释度为14 000)被加进,37孵育1 h，以TBST洗膜15 min3次。以ECL使之显现颜色后，于凝胶成像仪中进行曝光成像后，采用Image J 1.51软件，来分析蛋白条带灰度值，目的和内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值，这才能表示目的蛋白的表达水平。2)各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、TNF-、NF-B m RNA水平检测。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR）法。取“2.2”项

33、下各组大鼠结肠组织适量，剪碎后放入2 m L离心管，加入Triquick Reagent总RNA提取试剂1 m L，匀浆至无沉淀，静置5 min后加入氯仿0.2m L，振荡15 s；于4下以4 500 r/min离心15 min后，取上清液0.5 m L加至另一1.5 m L离心管中；加入异丙醇0.5 m L，置于室温下静置10 min；重复上述步骤3次，弃上清液。沉淀于65金属浴锅中烘干，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水0.03 m L溶解，经超微量核酸检测仪测定RNA浓度并按反转录试剂盒说明书进行操作，将所得c DNA置于-80冰箱内保存，待用。RT-PCR反应体系为Mon AmpTMSYB

34、RGreen q PCR Mix 10L,c DNA1L，正向引物（10mol/L)0.4L，反向引物（10mol/L)0.4L,H2O 8.2L；反应条件为95预变性30 s;95变性10 s,60退火30 s，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-Ct法计算各目标基因m RNA的表达水平。3)各组大鼠血清中相关炎症因子以及粪便样品中FC水平检测。采用ELISA法。取“2.2”项下血清/粪便样品适量，参照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清中TNF-、IL-6以及粪便样品中FC的水平。第四章 美沙拉嗪联合龟龙丸的临床药物试验观察4.1临床资料将40名溃疡性结肠炎患者随意分为

35、两组，第一组为美沙拉嗪组、第二组为美沙拉嗪联合龟龙丸组。诊断标准：正如炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年），该文件中的相关诊断标准，西医上判定是符合的，因为患者存在很多相像的症状，不仅腹痛甚至还腹泻，更别提里急后重，还有黏液脓血便这样的严重情况，病程大于4周，伴有关节、黏膜、皮肤等肠外表现。通过结肠镜检查后，基本可以看见该病的分布情况是持续的且弥漫的。在中医方面，也符合溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见（2017年）标准，大便黏腻、便脓血、腹痛、里急后重、肛门后灼、赤白相兼、小便赤短，舌苔黄腻，舌质红，脉弦数。4.2治疗方法两组患者均服用美沙拉嗪肠溶片，每次0.5g，每日三次。第二组患

36、者在服用美沙拉嗪肠溶片的基础上联合服用龟龙丸，每次2g，每日两次。两组均连续服用4周后观察疗效。4.3观察指标中医证候积分：治疗前及治疗4周后评估大便黏腻、便脓血、腹痛等症状改善情况，依据症状严重程度分别赋予0、2、4、6分，总评分越高表示症状越严重。炎症因子：治疗前及治疗4周后各抽取空腹静脉血3m L，离心处理后留取上层血清，采用酶联免疫吸附法测定血清中C反应蛋白（CRP）、白介素-1(IL-1）、白介素-8(IL-8）及肿瘤坏死因子-（TNF-）水平。4.4疗效标准临床症状及体征全部消失，结肠镜检查可见结肠黏膜恢复正常为痊愈。临床症状及体征较治疗前好转。结肠镜检查可见结肠黏膜炎症好转为有效

37、。症状无好转为无效8。第五章 可行性论证通过构建七组实验模型，首先对照组是必须的，其次还应该有结肠炎模型组，那么相应的美沙拉嗪组也必不可少，龟龙丸组、以及美沙拉嗪联合龟龙丸高、中、低剂量组。造模成功后，进行分组给药，可通过每天称大鼠体质量，观察大鼠一般状态及大便形状、测定脏器指数、评定结肠黏膜损伤情况以及测定血清中IL-4、IL-6的水平来确定美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎的改善作用。过程简单易行，且实验周期短。通过测定各组大鼠结肠组织中TLR4、TRAF6、NF-B蛋白表达水平、TLR4、TRAF6、TNF-、NF-B m RNA水平、以及大鼠血清中相关炎症因子以及粪便样品中FC水平，确

38、立美沙拉嗪联合龟龙丸对溃疡性结肠炎大鼠的作用机制。在经过以上动物模型实验研究后，设计临床试验。将40名患者随机分为美沙拉嗪组和美沙拉嗪联合龟龙丸组，连续用药四周后，通过中医证候积分、炎症因子的测定以及结肠镜观察患者结肠炎是否得到改善。综上所述，本实验设计安全有效、方便快捷，具有可行性。第六章 预期结果及分析6.1 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎改善作用的观察预期结果，两周后，患有结肠炎的大鼠在经过美沙拉嗪联合龟龙丸灌胃持续治疗后,大鼠的形态会有所变化，体重增加是一方面，毛色也会更有关泽，大鼠也会越发好动，活动也会增加，粪便的变化就更明显，是颗粒状或者条状，可以看出该大鼠的症状有了显著的减轻

39、。那么在结肠炎模型组中，经过TNBS诱导后，大鼠不仅会腹泻，形态和粪便的情况也不是很好，体重减少，粪便呈现一种稀水状；解剖后可以发现该大鼠的结肠组织也已经出现肠管变粗和肠壁增厚的现象，甚至还与腹腔内组织相粘连,明显能够看出结肠黏膜充血水肿,甚至形成糜烂和溃疡。在显微镜的观察下，该大鼠的结肠组织被大量炎症细胞浸润,甚至炎症累及结肠肠壁全层,大大破坏了肠黏膜腺体，而且分布杂乱,较多部位已经有糜烂和溃疡形成。几天后该组的大鼠表现为慢性炎症，那么用TNBS/乙醇混合溶剂对大鼠进行灌肠并注射这种药物之后，大鼠DAI、CMDI和TDI评分比对照组高了很多;单用美沙拉嗪和龟龙丸组评分高于联合用药组，而美沙拉

40、嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量、高剂量组的上述评分比结肠炎模型组低。美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组和结肠炎模型组两组相互对比,结肠黏膜层缺损未出现明显的再生修复,无明显差异;美沙拉嗪联合龟龙丸高剂量组与结肠炎模型组相比,结肠黏膜层缺损有一定的修复与改善。与对照组比较, 其他组的IL-4含量均显著降低, IL-6含量均显著增高。与结肠炎模型组比较, 美沙拉嗪联合龟龙丸低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-4、IL-6含量均有显著差异，高剂量组IL-4含量高于低剂量组，高剂量组IL-6含量低于低剂量组。三个联合用药组比两个单用药组IL-4含量高，IL-6含量低。分析原因为美沙拉嗪联合龟龙丸可以对UC大鼠的炎

41、症部位进行修复和改善，且美沙拉嗪联合龟龙丸高剂量组的粘膜完整性与低剂量组的粘膜完整性相比较显著提高，因此美沙拉嗪联合龟龙丸可以对UC大鼠的结肠炎起到改善作用且UC大鼠的结肠炎症与其血清中的抗炎因子IL-4和抗炎因子IL-6有着密切关系，且在一定范围内，IL-4含量越低，炎症作用越明显；IL-6含量约高，炎症作用越明显。美沙拉嗪联合龟龙丸对IL-4有着促进作用；IL-6有着抑制作用。美沙拉嗪合用龟龙丸比单独使用疗效好。6.2 美沙拉嗪联合龟龙丸对UC大鼠结肠炎机制的研究预期结果同对照组比较，在模型组中，组织中TLR4、TRAF6、NF-B蛋白的表达水平均显著升高；与模型组比较，各药物组大鼠结肠组

42、织中上述指标的表达水平均显著降低；那么相较于对照组，在模型组中，组织中TLR4、TRAF6、TNF-、NF-B m RNA表达水平均显著升高；与模型组比较，各药物组大鼠结肠组织中上述指标的表达水平均显著降低；与对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-、IL-6及粪便样品中FC水平均显著升高；与模型组比较，各药物组大鼠血清/粪便中上述指标水平均显著降低。分析原因为NF-B是一种蛋白质复合物，在静息状态下因NF-B/Rel蛋白二聚体与抑制蛋白IB结合而处于失活状态；而TLR4属于型跨膜糖蛋白受体，在细胞表面能够识别病原相关分子，在活化信号转导中起到桥梁作用。当TLR4/NF-B信号通路被异己抗原激活后

43、，其细胞表面受体会发生构象改变，激活激酶1和代谢性炎症的IK复合物使其磷酸化，并由泛素连接酶引导，从而可被泛素化和被溶酶体识别并降解，于是NF-B从NF-B抑制因子（IB）重组蛋白复合物中脱离出来，暴露出核定位域，且迅速发生核转位，通过与EB病毒靶基因反应元件结合，启动了相关炎症因子（如TNF-、脂多糖、IL-1、过氧化氢等）的表达；而产生的炎症因子又进一步激活NF-B，从而形成恶性循环，使病情不断恶化。牛亚蒙等9在研究内毒素性肝损伤时发现，解毒化瘀通腑方可抑制TLR4/NF-B信号通路的激活，减少炎症因子的释放，减轻内毒素引起的肝损害。由此可见，TLR4/NF-B信号通路通过调控炎症因子的表

44、达在疾病发生、发展中起着重要的作用。6.3美沙拉嗪联合龟龙丸的临床药物试验观察预期结果为美沙拉嗪组和美沙拉嗪联合龟龙丸组炎症因子均有所下降，但美沙拉嗪联合龟龙丸组比单用美沙拉嗪组炎症因子数值低。并且通过结肠镜检查，可以发现合用药组比单用药组炎症部位恢复的效果好。分析原因为联合用药能够更好的发挥药物的效果，且不良反应少，美沙拉嗪联合龟龙丸治疗溃疡性结肠炎疗效较好，可降低中医证候积分，减轻炎性反应，缓解肠道症状，促进溃疡愈合，安全可靠。参考文献1 DOvidio V，Meo D，Gozer M，et al.Ulcerative colitis and granulocyte-monocyte-ap

45、heresis: safety and efficacy of maintenance therapy during pregnancyJJournal of Clinical Apheresis，2015，30( 1) : 55-572马清林,杜丽东,臧凯宏,孙敏,曹如冰,任远.溃疡性结肠炎研究进展概述J.医药论坛杂志,2020,41(01):175-177.3 Amiot A，Serrero M，Peyrin-Biroulet L，et alOne-year effectiveness and safety of vedolizumab therapy for inflammatory b

46、owel disease: a prospective multicentre cohort studyJAliment Pharmacol Ther，2017，46( 3) : 310-3214王新月，浏果，盛益华溃疡性结肠炎流行病学特点与中医病因病机探讨J中国中医基础医学杂志，2011，( 15) : 481-482.5 Lie Zheng,Ya-Li Zhang,Yan-Cheng Dai,Xuan Chen,De-Liang Chen,Yue-Ting Dai,Zhi-Peng Tang.Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative

47、colitis by inhibiting nuclear factor-B activationJ.World Journal of Gastroenterology,2017,23(07):1180-1188.6张晶娜,陶磊,张俊,王木岭,陈莹,刘衡,张成桂,何苗.美洲大蠊提取物Ento-A对湿热型溃疡性结肠炎模型大鼠的改善作用研究J.中国药房,2020,31(01):35-41.7梁运特,黄仲海,廖志远,张琴,汤勇,孙平良.安肠汤对TNBS致溃疡性结肠炎模型大鼠TLR4/NF-B信号通路及粪钙卫蛋白表达的影响J.中国药房,2021,32(02):189-194.8刘明顺.补脾泻火方联合美

48、沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎临床观察J.实用中医药杂志,2021,37(03):458-460.9牛亚蒙,刘江凯,刘香丽,李聪聪,董永春,刘少颖.基于TLR4/NF-B通路的解毒化瘀通腑方干预内毒素性肝损伤的作用机制J.时珍国医国药,2020,31(05):1029-1033.致谢随着毕业论文的完成，我短暂的大学生涯也即将划上句点，回首走过的点点滴滴，多么想把青春停留在这个时点，让时针走的慢一点再慢一点，让我有足够的时间来抒发我的感激、不舍和眷恋。首先要向我的导师盛益华老师表示我最衷心的感谢。是她将我领入了临床药学的大门，半年多来，他为师的传道授业解惑，为学问的严谨和审慎，对我的人生起到了很大的导航

49、作用。作为他的学生我深感自豪和荣幸。我希望自己在未来的道路上能够继续传承老师的知识，不断努力，保持自己奋斗的精神，成就自己的一片天空。同时我也要感谢各位答辩老师在论文初期开题报告和后期的评阅中给予了我大量的修改意见及指导，让我对论文的撰写方法、数据搜集方式有了更深刻的认识和理解，您们的宝贵批评及悉心指导，严谨的治学风格和对于细节精益求精的态度，使我受益良多，为论文的撰写及修改指引了方向，论文的完善离不开老师们的付出与心血。在吉首大学求学的这段时间，我在临床药学方面的理论知识有了较大的进步，这些知识和进步的取得与老师们的辛勤工作是分不开的，在此，向吉首大学药学院的所有老师们表示衷心的感谢和诚挚的敬意。人逢知己千杯少，难得在漫漫人生路上能认识你们，在一起走过的日子，非常的感谢你们给我的帮助，我始终不能忘记我们友谊，不能忘记我们在一起的点点滴滴，在大学生涯中我们共成长、共欢笑、共进步，也是因为有你们的陪伴让我的大学时光更加的绚丽多彩，借此机会，我还要特别感谢我的父母，没有你们这么多年对我的无私付出也不会有我的今天，你们用最真挚的爱为我铺就了成长的道路。最后，向在百忙之中审阅本文的老师表示感谢!同样，因为自身知识水平有限，笔者的论文难免会有所疏漏，诚挚的感谢各位老师和专家学者们能够对我的文章提出批评和指正。14