SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项

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1、SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。作 用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 而强还原剂如疏基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中 加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和 结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓 冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为p

2、H8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种 pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的 主要因素。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离 成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其 中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白， 因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋 白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在

3、移动界面附近，浓缩成一中 间层。过硫酸铉（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铉产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链 间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下 式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量 的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下 进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中

4、纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对 应于各个亚基的几条带。SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微 克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知 蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。Acr :丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铉化学催化剂TEMED:四甲基乙二胺加速剂实验材料1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis为29:1）：将60ml水预热至37摄氏度，加入丙烯酰胺（Acr） 29g及甲叉丙烯酰胺（Bis），溶解并补水至100ml。用0.45微

5、米孔径滤纸过滤，查证溶液pH 值不超过7.0。贮棕色瓶中于4C保存，可用一个月。（Acr） 29.2g及（Bis） g丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有 累积效应。称量时应戴手套和口罩。2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 取 1mol/L HCL 溶液 48ml、三羟甲基甲烷（Tris），加双 蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8,然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4C 贮存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液 取 1mol/L HCL 溶液 48ml，Tris，加双蒸馏水至 80ml，

6、调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4C贮存。100ml分离胶1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加加HCL 调pH至8.8,加水定容至100ml。室温保存。100ml积层胶:将Trisg完全溶于50ml去离子水中，加HCL调pH至6.8,加水定容至100ml。 室温保存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液94g甘氨酸，加入50ml 10% （w/v） SDS （电泳级）存储液（）， 用去离子水补至1000ml。pH 8.3。5、10%过硫酸铵（AP）：过硫酸铵于1.5ml进口 EP管中，用时加1ml去离子水溶解。2周 内使用

7、。6、10%SDS （十二烷基磺酸钠）：在900ml水预热至68摄氏度，加入100g电泳级SDS溶 解，补水至1000ml。SDS颗粒易扩散，称量时戴面罩。10%SDS无需灭菌。室温保存。7、四甲基乙二胺（TEMED）： 10% TEMED 0.1ml TEMED ,加 0.9 ml 蒸馏水。8、上样缓冲液 取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS，1g/L漠酚蓝 10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl （pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，漠酚兰，10g蔗糖， 加水定容至100ml。2X样

8、品缓冲液（10ml）：甘油2ml，漠酚蓝，1MTrisCl （） 1ml巯基乙醇，10%SDS 4ml。 2X上样缓冲液（10ml）： 0.6ml 1mol/L Tris-HCL （pH6.8） 4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS，2ml 1mol/L二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%漠酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4C存放数周，或在-20C 保存数月。2X上样缓冲液（10ml）： 1ml 1mol/L Tris-HCL （pH6.8） 2ml 100%的甘油，4ml 10% SDS，2ml 1mol/L二硫苏糖醇（DTT），2g溴酚蓝，1ml去离子水，在-20C保存数月。9、考马斯亮

9、蓝R250染色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液，溶解考马 斯亮蓝R-250，加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。用 Whatman 1号滤纸过滤染液去除颗粒物质。不可隔夜以免影响染色效果。10、脱色液：45ml去离子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液。取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。考马斯亮蓝脱色液：10ml甲醇，10ml冰醋酸，80ml蒸馏水。11、蛋白质分子量标志物：市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择5种以上的已知分 子量蛋白质自行配制，注意其分子量分布要能满足需要，各种蛋白质的浓度基本相等。配制Tris

10、-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液溶液成分总体积5 ml总体积10ml总体积15ml总体积20ml总体积25ml总体积30ml6%水30%丙烯酰胺Tris(pH 8.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED8%水30%丙烯酰胺Tris(pH 8.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED10%水30%丙烯酰胺Tris(pH 8.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED12%水30%丙烯酰胺Tris(pH 8.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED15%水30%丙烯酰胺Tris(pH 8.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓

11、缩胶溶液溶液成分总体积3ml总体积4ml总体积5ml总体积6ml总体积8ml水30%丙烯酰胺1M Tris(pH 6.8)10% SDS10%过硫酸胺TEMED四、实验方法1、用1 %琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12%分离胶（15ml）,凝胶液加至约距 前玻璃板顶端（距梳子齿约），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约 30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。将水倒出，吸干， 灌满5%浓缩胶（8ml，4ml用于Mini-Protein III型电泳槽）后立即插入梳子，冷凝30分后 取出梳子。2、预电泳：将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝

12、胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内； 接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳35min。3、取20-30四1蛋白提取液与20-30四1样品缓冲液混合，于100C水浴加热3-5min使蛋白变性 （离心510s），用微量进样器以50/的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。取20ul收集液，加入5乂样品缓冲液5ul，在80C水浴锅中煮5min。取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml，混匀，在沸水中煮沸min。4、打开电源将电压调到80v，待样品跑过压缩胶后将电压调到120-150V至电泳到胶底部 为止。5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2-3h （染色时间需根据凝胶厚度 适当

13、调整）；待条带清晰后倒出染色液，凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更 换脱色液23次，震荡达24h以上。将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液加入染色液将凝胶完全浸 泡其中，放入微波炉内，高火档照射0秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上 色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档蛔，倒出脱色液， 再加入新鲜脱色液照射20秒，重复56次，直至背景清晰透明于凝胶分析仪上成像分析。【注意事项】1. 凝胶不聚合的可能原因（1）试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。（2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。（3）凝胶聚合时

14、温度太低，应以室温为宜。2. 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔 底部留有聚合的丙烯酰胺。3. 经过煮沸的样品虽然可以在-20C保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20C 取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。4. 注意避免电泳条带弯曲畸变：“微笑”现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高， 降低电压便可得到改善.“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。“拖 尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即 可克服。（主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选

15、择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。） “晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。5. 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。6. 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测，须特别注意：1）已知和未知样品必须使用相同 的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量，并在同一块凝胶上电泳和染色。2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基 化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT （或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象 被

16、解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一 般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再 离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象100ul 样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1 %SDS沸水中煮3min，未 加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。4.提高SDS-PAGE电泳分

17、辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温 下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。9.什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶 中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而 失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其 分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB反

18、应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或 可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。11. 为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽 没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝 缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。处理办法：电泳槽正确装配即可。14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该 现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过 多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。15. 电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等 电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。