第四章核酸解析

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1、第四章 核酸第一节 概论一、核酸的发现和研究简史（一）核酸的发现 1868年瑞士青年科学家 Miescher 在外科绷带脓细胞分离得 到细胞核，从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物称为核 素。 1889年Altmann发明了从酵母和动物组织中制备不含蛋白 质的核酸的方法。首次提出了核酸的名称。 1894年Hammars证明了酵母核酸中的糖是戊糖。 1909年Levene年确定戊糖是2-脱氧-D-核糖。 19世纪末20世纪初Kossel鉴定了碱基。 （二）核酸的早期研究 Levene “四核苷酸假说”阻碍了核酸的研究。 20世纪40年代，显微紫外分光光度法、组织化学法、亚细胞 单位的分离与化学分

2、析法的应用，推翻了“四核苷酸假说”。（三）DNA双螺旋结构模型结构的建立 早期分子生物学的三个学派：结构学派：Astbury用X-射线结晶学技术研究生物大分子的 三维结构，并认为研究其起源和功能是分子生物学的主要任 务。信息学派：Delbruck, Schrodinger、SLuria 认为生命的 本质是信息传递的问题：信息如何被编码？如何保持其稳定 性？偶然的变异是如何产生的？ 生化遗传学派：用生物化学的方法阐明基因是如何行使功能 而控制特定性状的。 1953 Watso n和Crick提出DNA双螺旋结构模型。说明了基因 的结构、信息和功能三者的关系，使三个学派得到统一，并 推动了分子生物

3、学的发展。 1956年Kornberg发现DNA聚合酶。DNA双螺旋立体结构 1961年Jacob Monod提出操纵子学说，并假设了 RNA的功 能。 1965年Holley测定了酵母丙氨酸RNA的核苷酸序列。 1966年Nirenberg破译了遗传密码。 1970年发现了逆转录酶。 （四）生物技术的兴起七十年代前期DNA重组技术的建立的基础： DNA的 切割技术一工具酶的发现和应用。分子克隆一DNA体外重组体的无性繁殖。 1975,1976 快速测序一酶法与化学法测序技术的建立。 基因重组技术可应用于改变生物机体的性状特征、改造基因、 以至改造物种。导致了新的生物技术产业群的兴起。 198

4、1年Cech发现了核酶一催化功能。 1983年Simons,Mizuno 反义RNA调节功能。 （五）人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元 1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划，在经过 各国科学家的多年努力，已取得巨大的成就。十多种低等模 式生物的基因组序列测定已完成；第一个多细胞生物线虫基因组的 DNA全序列测定也在1998年底完成； 人类基因组的全序列提前到2003、 4、 14完成。 生命科学已进入了后基因组时代，研究重心已从基因测序转 移到基因的功能。 功能基因组学 蛋白质组学 结构基因组学 RNA组学 二、 核酸的种类和分布（一）、类别：核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）、核

5、糖核酸(RNA)。核糖核酸(RNA)分成三类： 1、信使RNA (mRNA):单链差别较大，其顺序决定蛋白质 的氨基酸顺序。 2、转移RNA (tRNA):携带氨基酸，核糖体上，每种氨基 酸至少有一种tRNA。 3、核糖体RNA (rRNA):不稳定，与核蛋白结合。 二、分布： 1 、 DNA: 原核生物集中于核区.真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有DNA. 原核、真核生物的质粒病毒含有DNA或RNA. 2、 RNA 存在于细胞质和细胞核中。发现了许多新的具有特殊功能的RNA:如反义RNA，核酶等.病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA病毒、负链RNA病毒、 类病毒、卫星病毒等 . 三、核酸

6、的生物功能 (一) DNA是主要的遗传物质 1 、细菌转化实验 2、噬菌体侵染实验证明了 DNA是主要遗传物质 3、有些病毒的遗传物质是RNA.（二）RNA参与蛋白质的生物合成 rRNA占细胞总RNA的80%，它是装配者并起催化作用. t RNA占细胞总RNA的 15%，它是转换器，携带氨基酸并起 解译作用. mRNA占细胞总RNA的35%，它是信使，携带DNA的遗传 信息,并起蛋白质合成的模板作用.（三）RNA功能的多样性 1 、控制蛋白质合成. 2、作用于RNA转录后加工与修饰. 3、基因表达与细胞功能的调节. 4、生物催化与其他细胞持家功能. 5、遗传信息的加工与进化.第二节 核酸的结构

7、 核酸 全部磷酸二酯键断裂 核苷酸 核苷酸磷酸单酯键断裂核苷 +磷酸 核苷 糖苷键断裂碱基+核糖 核酸 部分磷酸二酯键断裂寡核苷酸 一、核苷酸（一）核酸中的糖 D核糖D2脱氧核糖二者都是B型。 差别：2 位羟基是否脱氧。脱氧核糖与核糖 （二）碱基： 1 、嘌呤碱 2、嘧啶碱 3 、稀有碱基 稀有碱基大部分都是甲基化碱基 tRNA稀有碱基约占10%嘌呤碱基和嘧啶碱基（三）核苷：戊糖与碱基通过糖苷键相连，CN糖苷键。糖C与嘧啶碱N与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。 根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。命名先冠以碱基名称，糖环C加，碱基不加。 核苷的顺式结构和反式结构。 RNA某些

8、修饰化和异构化的核苷，碱基、核糖均可被修饰, 主要是甲基化。 tRNA、rRNA还含有少量假尿嘧啶核苷。核苷（四）核苷酸戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。 核糖核苷糖环上有3个自由羟基。 脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。 环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。核苷酸二、核酸的共价结构（一）核酸中核苷酸的连接方式RNA通过3，5 -磷酸二酯键连接的核苷酸。DNA通过3，5-磷酸二酯键连接的核苷酸。 表示方法：书写顺序53。核苷酸的组成与连接 1、线条式：竖线碳链、碱基、磷酸 2 、文字式： 5 pApCpTpTpGpApApCpG3 DNA5 pApCpUpUpGpApApCpG3 RNA 此式可

9、进一步简化为： 5/ACTTGAACG3/5/ACUUGAACG3/（二）DNA 1 、一级结构 DNA的一级结构A、T、G、C通过3, 5-磷酸二酯键连接，C：一碱基, C 脱氧。2碱基：A、T、G、C 脱氧核糖 没有侧链DNA的一级结构 DNA的相对分子量非常大，通常一个染色体就是一个DNA 分子，最大的染色体DNA可超过108bp 能编码的信息量十 分巨大。 细菌的基因是连续的 ,无内含子功能相关基因组成操纵子,有 共同的调控序列,较少重复序列。 真核生物的基因是断裂的,有内含子功能相关基因不组成操 纵子,调控序列占比重大,有较大重复序列。 越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越

10、大。 2、二级结构 （ 1）、模型建立的依据： a Chargaff 等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各 种生物 的DNA的 碱基组成。结果显示： 摩尔数：A=T；G=C；A+C=G+T； A+G=C+T (2)、DNA双螺旋的结构特征： A、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋； B、骨架：内侧碱基垂直于纵轴； 外侧 磷酸与戊糖、彼此通过 3、 5磷酸二酯键，糖环平 面与纵轴平行。大沟宽 12nm, 深0.85nm ；小沟宽06nm,深075nm ； C、直径：2nm，二相邻碱基高度034nm,二核苷酸夹角36 度，旋转一周10个核苷酸，一周高度3.4nm ； D、碱基互补配对

11、：A、T形成两个氢键；G C形成三个氢键, 碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。(三)DNA二级结构的多态性 DNA分 子结构可受环境的影响而改变 B型DNA：在相对湿度92% 下制得的纤维是B型结构，适中。 A型 DNA :在相对湿度75%下制得的纤维是A型结构，宽短。 Z型DNA :碱基与中心的倾角9C,细长。三股螺旋DNA.人工合成DNA发现，第三股嵌在大沟里。 2、三级结构： 细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进 一步扭曲就构成了三级结构。 超螺旋，三级结构中的一种。 DNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。 （三） RNA 1、RNA结构的特点 RNA与DNA结构十分

12、相似，二者相比有几点不同： （ 1），核糖： （2），碱基： A、 G、 C、 U （3），二者在三维结构上的区别 RNA不具有规则的氢 键结构，单链形式存在，只是回折，局部配对，不配对形成 突环。 2、 tRNA 由70-90个核苷酸组成，在蛋白质合成过程中具有转运氨基 酸、识别密码子的作用，在DNA反转录合成及基因表达调控 中起着重要的作用。 （1）、结构特点： A、有较多的稀有碱基，多为转录后加工而来 B、3末端为氨基酸接受臂CCA。 C、5末端作为G or Co 2、二级结构 三叶草形：叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。 A、接受臂：接受活化AA,末端为CCA。 B、T&C环：&假鸟

13、嘧啶，有T/C顺序。 C、额外环：变化最大区域，不同tRNA不同大小额外环。 D、反密码环：7个核苷酸组成，环中部反密码子。三对碱基 组成。 E、二氢尿嘧啶环：8-12核苷酸，两个二氢尿嘧啶。 3、 rRNA rRNA占RNA总量的 80%以上，核糖体由大小两个亚基组成, 大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。 rRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。核糖体上催化肽键合成的是rRNA,蛋白 质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。 4、mRNA （1）原核生物mRNA结构特征原核生物的mRNA链上有多个编码区（多个基因），为多顺 反子， 5和3端各有一段非翻译区

14、。多顺反子：一个转录本加工而成的 mRNA序 列中包含多个基 团。编码区：mRNA中以AUG为起点，以终止密码子为终点，编 码AA的一系列密码子序列。 （2）真核生物mRNA结构特征真核生物的mRNA都是单顺反子。单顺反子：一个转录本加工而成的 mRNA序列只代表一个基 因。 mRNA5端都有帽子结构。绝大多数真核生物mRNA具有poly（A）尾。 帽子结构功能： a、增加m RNA稳定性，保护mRNA免遭5外切酶的攻击。 b、有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起 始。 mRNA poly（A ）尾功能： A、防止mRNA降解，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。 B、是mR

15、NA穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。 C、与翻译有关；切除poly（A）尾会影响翻译起始。第三节 核酸的性质及研究方法 一、核酸的水解： （一）酸水解： 磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。 磷酸酯键比糖苷键稳定； 嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定； 嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定 。 （二） 碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解；DNA的磷酸酯键对碱稳定。 原因： 1、RNA核糖上2-OH基，在碱性条件下形成磷酸三酯，磷酸 三酯极不稳定，随即水解，产生2，3环磷酸酯，进而分解 成2，3核苷酸 2、DNA核糖上无20H基，不能形成磷酸三酯中间物，因此 可以抵抗碱水解。 （三）酶水解： 1、

16、核糖核酸酶 (1)牛胰核糖核酸酶： 专一性切割位点：嘧啶核苷 -3-磷酸与其它核苷酸之间的连 键。 产物： 3-嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。 水解机制：同碱相似。(2) 核糖核酸酶 专一性切割位点： 3-鸟苷酸与其相邻的 5-核苷酸之间的连 键。 产物： 3-鸟苷酸；或以3 -鸟苷酸结尾的寡核苷酸。(3) 核糖核酸酶T2 专一性切割位点： 3-腺苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连 键。 产物： 3 -腺苷酸结尾的寡核苷酸。 脱氧核糖核酸酶 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链DNA成为5磷 酸为末端的寡核苷酸，平均长度4个核苷酸。 (2)牛脾脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链D

17、NA成为3磷 酸为末端的寡核苷酸，平均长度6个核苷酸。 (3)链球菌脱氧核糖核酸酶：产物为5-磷酸为末端的寡核 苷酸，长短不一。 (4)限制性内切酶：在细菌中发现这类酶，主要降解外源DNA,对自身DNA无作用。 特点：切割位点往往是回文结构；具有高度专一性，识别双 链特定的位点，将两条链切开成粘性，平头末端；用于染色 体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组。二、核酸的酸碱性质 1、碱基的解离 嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮和取代基具有结合和释放质子 的能力，因此是兼性离子； 胞嘧啶的解离； 胸腺嘧啶的解离； 腺嘌呤的解离； 鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离； 2、核苷的解离：糖的存在增加了酸性解离 3、

18、核苷酸的解离： 磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。 三、核酸的紫外吸收： 碱基的共轭双键决定了核酸有紫外吸收。最大光吸收值260nm，是核酸定量以及定性的基础。用A /A 的 比值可以判断样品的纯度：260 280纯DNA的 A260/A280比值应大于1.8,260 280纯RNA应达到2.0;摩尔吸光系数8：L。单核苷酸8 (P)值大于单链多核苷酸;单链核苷酸8 (P)值大于双链核苷酸，因此核酸变性时，8 （P）值增高，称增色效应；核酸复性时,8 （P）值降低，称减色效应。四、核酸的变性、复性及杂交 （一）变性： 1、概念：双螺旋氢键的断裂，不涉及共价键-磷酸二酯键断 裂。 2、引起变

19、性的因素： 1）温度的升高； 2）碱酸度改变； 3 ）尿素、甲醛等。 3、变性的特点： 1）结构变成无规则线团； 2） 260nm紫外吸光度升高，粘度下降； 3）爆发式，变性发生在很窄的温度范围，有一个相变的过程熔解温度（Tm值）：双螺旋失去一半时的温度。4、影响DNA Tm的因素：（1）DNA均一性：均质DNA熔解过程在一个较窄的温度范围内；异质DNA熔解过程在一 个较宽的温度范围内。（2）G-C含量：G-C含量越高Tm值愈高；原因： G C A=T测定Tm可 以推算出DNA碱基的百分组成。经验公式： XG-C=（ Tm-69.3）X2.44； （3）介质离子強度离子強度较低的介质中,Tm值

20、较低，熔解温度范围较宽；离子強度较高的介质中,Tm值较高，熔解温度范围较窄。 RNA的变性：螺旋区较少，变性Tm值较低；tRNA螺旋区较多，变性Tm值较 高，类似于DNA。 （二）复性 两条分开的链重新闭合为双螺旋称复性，复性可部分恢复理 化性质，变性DNA骤然降温不能复性，据此可制备单链核酸 探针。 缓慢冷却复性称退火。片段越大复性越慢；浓度越大复性越 快。双螺旋呼吸：双链DNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含A-T的区段。在微观上， 常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸 作用。一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和 识别DNA内部 所

21、含信息。 （三）核酸的杂交： 1、概念：不同来源的分子，经热变性后冷却复性，如异源间 某些区域有相同的序列，则会形成杂交分子。（四）、DNA聚合酶链反应（PCR）原理：1、变性：通过加热使双链DNA变成单链DNA。2、退火：温度突然降低，引物与模板链局部形成杂交链。3、延伸：在DNA聚合酶的作用下，进行DNA链延伸反应。以上三步为一个循环。基本步骤：1、设计一对引物：应尽量减少非特异产物。2、优化反应体系：适量模板，引物，4种dNTP,TaqDNA聚合酶,Mg+。3、选择热循环温度：变性温度，退火温度，延伸温度4、鉴定扩增产物：一般用凝胶电泳。 2、Southern杂交：固相杂交扌样品酶 五、核酸含量的测定： 1 、定磷法：样品灰化：浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷钼酸胺磷钼酸+还原剂钼蓝。 2、定糖法：RNA戊糖糠醛+苔黑酚+三氯化铁绿色 DNA脱氧戊糖羟基酮醛+二苯胺蓝色 3、紫外吸收法：测碱基六、核酸的凝胶电泳用与核酸的分离、鉴定。 核酸带负电荷正极，超螺旋最快，线形次之，开环最慢。 1、琼脂糖凝胶电泳：核酸大片段， 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：核酸小片段。溴化乙锭（EB）, 紫外光下萤光显色。 思考题： 1、简述tRNA、rRNA、mRNA在蛋白质合成中的作用。 2、试比较DNA和RNA在结构和功能上的区别。