EBV抗体酶联免疫诊断试剂.ppt

《EBV抗体酶联免疫诊断试剂.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EBV抗体酶联免疫诊断试剂.ppt（31页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、EB病毒 IgA抗体酶联免疫 吸附法诊断试剂盒 （受理号： X0407269 ） 中山大学中山医学院 朱振宇教授、医学博士、博士生导师 中山大学达安基因股份首席科学家 一、 鼻咽癌与 EB病毒感染的关系 鼻咽癌 （ NPC） 是来源于鼻咽粘膜上皮 细胞的低分化或未分化癌 。 本病可见于世 界各地 ， 但 NPC有明显的种族倾向 ， 大部 分患者是中国人及其后裔 ， 在爱斯基摩人 、 北非洲人和马来人中也较常见 。 病人的肿瘤细胞中有规律地隐匿着潜伏 状 态 的 EB 病毒 （ Epstein-Barr Virus ， EBV） 。 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着 EB病毒 发现 EB病毒是 196

2、4年 Epstein与 Barr在非洲儿 童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种疱 疹病毒。 1966年 Old等采用免疫扩散法发现鼻咽 癌病人的血清能与非洲儿童淋巴细胞的抽 提液起反应 。 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着 EB病毒 证据 （ 1） ： 1969年 de-the从鼻咽癌活检培养的类淋 巴细胞中分离出 EB病毒 。 国内也已经从鼻咽癌组织培养所建立的 类淋巴母细胞株中证明带有 EB病毒壳抗原 （ VCA） 和早期抗原 （ EA） ， 并在电镜下找 到了典型的疱疹病毒颗粒 ， 其形态与 EB病 毒相同 。 1、病人的肿瘤细胞中隐匿着 EB病毒 证据（ 2）： Kottaridis SD等（

3、 1996年）认为 鼻咽 癌患者 血清中抗 EBNA的水平反映肿瘤的大 小 。 Anticancer Res,1996,16(2):785-789 Vera-Sempere FJ等（ 1996年）采用巢式 PCR和免疫组化分析说明了不论组织学类 型，鼻咽癌中均有 EB病毒感染。 Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168 2、 几乎 100%鼻咽非角化性癌均有 EBV感染。 在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染 过 EBV， 80%以上的健康成人是 EBV携带者。特 别在珠江三角洲及香港地区，是世界上 NPC的高 发区。 根据中山市的肿瘤统计资

4、料（ 流行病学 ）， NPC的年龄和性别的校正发病率为 18.12/10万 (男： 25.60 /10万；女： 11.05/10万 )。 97%的 NPC为非角 化性癌。经 EBER1原位杂交（所谓 “ 金标准 ” ） 证实癌细胞中有 EBV感染。 EBERs原位杂交 3、 NPC病人血清中的 EBV抗体水平普遍升高 NPC的显著特征是病人血清中 对 EB病毒各种抗 原的抗体 （ 尤其是 IgA亚型 ） 水平普遍升高 ， 借此 可区分 NPC与健康携带者 。 （ Werner Henle et al., 1976. ） 中国医学科学院等单位采用间接免疫荧光法 ， 发现 鼻咽癌患者 血清中 Ig

5、A/VCA的阳性率为 90.14 ， 几何平均滴度为 1:15.3,而其它癌瘤和健康携带者血 清中 IgA/VCA的阳性率为 2.61%-3.30% ， 几何平均滴 度为 1:1.3。 同时还发现鼻咽癌病人放疗后 ， 其 IgA 抗体水平随存活时间的延长而逐渐下降 ， 在放疗后 4 22年者仅 39.29 为阳性；但当病者出现肿瘤复 发或转移时 ， 阳性率又再次升至 85.75 。 一、 鼻咽癌与 EB病毒感染的关系 小结： 流行病学 、 血清学和分子生物学的资 料证实 , EBV感染与 NPC有密切关系 。 鼻咽癌患者癌细胞中证实有 EB病毒的 DNA， 经 原位杂交 ， 多数癌细胞呈 EB

6、ERs阳性 、 核抗原 （ EBNA-1） 阳性 。 鼻咽癌患者肿瘤细胞中有 EB病毒 ， 血清有一 套抗 EB病毒的抗体 ， 血清中的 EBV抗体水平普遍 升高 。 1997年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上 把 EBV归类为第一类致癌物 （ 特别是鼻咽癌 ） 。 二、 EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中 EBV抗体的不同 EBV血清学诊断利用 NPC的一个特征，即 患者多种 EBV抗体的水平较非患者高 （ Werner Henle et al.,1976.） 。 EBV血清学诊断已用于 NPC高危人群的筛 查和对 NPC可疑病例的诊断。根据从 70年代后 期以来的研究结果， VCA-IgA

7、检测通常被用于 筛查以排除 NPC的诊断 ； EA-IgA检测目前被用 于 NPC的确定性检测。 二、 EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中 EBV抗体的不同 检测哪种抗体？ 检测抗体哪种类型？ 因为鼻咽癌 （ NPC） 是来源于鼻咽 粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌 。 所 以我们可以先了解 EB病毒 在上皮细胞中 的潜伏感染 以及 两种形式的 EB病毒感染 所表达的各种抗原 。 各种抗原相应产生不同的特异性抗 体中哪种有代表性 ？ 1、 EB病毒的潜伏感染 上皮细胞中病毒复制 循环中的 B淋巴细胞池 长期潜伏感染 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 EB病毒 感染口咽上皮细胞 如果感染了复制缺陷突

8、变的病毒 待上皮细胞增生后 个别细胞死亡 EB病毒 引自 : J Immmunol. 2005; 17498:4972-8 2、两种形式的 EB病毒感染 潜伏性感染 (latent infection) I型潜伏性感染 : 表达 EBNA1， 病征为 Burkitt 淋巴瘤 II型潜伏性感染 :表达 EBNA1和 LMP1、 LMP2A、 LMP2B， 病征为 Hodgkin 淋巴瘤 、 鼻咽癌 、 鼻型 NK/T-细胞淋巴瘤 、 T-细胞淋巴瘤 III型潜伏性感染 :表达 EBNA1、 EBNA2、 EBNA3、 EBNA4、 EBNA5、 EBNA6， 病征为传染性单核细胞增多症 、 移植

9、后淋巴 组织增生性疾病 溶解性感染 (lytic infection) 在 EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小部分 （ 约 15% 20%） 出现溶解性 感染 ， 溶解性感染出现三个时相 （ phase） 。 立即早期 : 表达 Zta(ZEBRA)、 EBNA1等 早期 : 表达 EA(D)、 EA (R) 、 EBNA1等 晚期 : 表达 VCA、 EBNA1等 EBNA-1 是在所有不同 EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。 3、检测抗体哪种类型？ 遵循免疫学抗体产生的基本原则 IgG IgM IgA是上皮细胞的分泌型抗体 IgD IgE 二、 EB病毒携带者与鼻咽癌病人 血清中 EBV抗体的

10、不同 检测 对象 例数 EBNA1/IgA（ rOD） 中位数 范围 鼻咽癌 121 2.6 0.47.5 患者 健康 332 0.5 0.23.9 携带者 NPC病人血清中的 EBNA1/IgA抗体平均水平是 健康携带者的 4倍以上 。 EBNA 1 IgA 的抗体水平 在 NPC患者中高于正常的 EBV携带者 E B N A 1 - I g A 检测的 OD 值范围分布图 0 5 10 15 20 25 30 35 - ( 0 . 8 - 0 . 7 ) - ( 0 . 6 - 0 . 5 ) - ( 0 . 4 - 0 . 3 ) - ( 0 . 2 - 0 . 1 ) 0 - 0 .

11、1 0 . 2 - 0 . 3 0 . 4 - 0 . 5 0 . 6 - 0 . 7 0 . 8 - 0 . 9 O D R a n g e % % N o r m a l % N P C Cutoff OD? 小结 NPC主要表现是 EBV潜伏感染伴少量溶解性感 染 。 EBNA-1 是在所有不同 EBV感染细胞中都出 现的唯一抗原 。 NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞 ， 检测上皮细 胞的分泌型 IgA抗体水平对 NPC较有诊断意义 。 NPC的显著特征是病人血清中的 EBV抗体 （ 尤 其是 IgA亚型 ） 水平普遍升高 ， 这种变化在 NPC发 病前期将先于症状出现 ， 借此可区分 N

12、PC与其它 EB病毒感染相关疾病或健康携带者 。 我们认为 EBNA1/IgA抗体水平的检测对 NPC高 危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段 之一 。 三 本品是用于 NPC 辅助诊断的有效手段 NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的一种恶性肿瘤，组织病理 学检查是确诊 NPC的唯一方法。 NPC的早期症状是非特异的， EBV血清学体外诊断最常用 于诊断程序的初期及 NPC高危人群的筛查。 NPC的显著特征是病人血清中的 EBV多种抗体水平普遍升 高，因此一种抗体的检测有一定的局限性。 本品的设计应用 ELISA技术 ，采用了高度纯化的 EBNA 1的 抗原 ，它的抗体水平在鼻咽癌和非鼻咽癌

13、患者之间的差异， 大于那些不是由肿瘤细胞所表达的抗原的特异性抗体。同时 每个试剂盒中加入了一份定值参考对照，在每次的检测中与 测试样品同时进行检测，使抗体的水平以标准的 rOD单位来 表示 ，这样可以减少实验之间和实验室之间的误差，从而 可以直接地比较不同的实验室在不同的时间所独立得出的检 测结果。 1、本品的用途和局限性 用途 本品适用于疑似鼻咽癌病人的血清学检测， 检测结果有助于临床医生作出排除或进一步确 认 NPC 的诊断。 主要可用于高危人群的筛查。 局限性 本品并非 NPC诊断的确诊试剂 ， 只有组织 病理学检查能确诊 NPC。 检测结果只提供了额外的信息，以指导对 疑似 NPC病例

14、的诊断。同时对健康人群来说， 检测结果 可能反映 NPC的风险程度。 2、本品的使用特点 推荐使用的诊断参数及其临床意义： 当疑似鼻咽癌症状的病人首次到专科门诊就诊时，血清 学诊断可作初步筛选， 此时敏感性为主要的诊断参数 。 其目的是评估病人被诊断为鼻咽癌的可能性大小。 推荐 使用当 rOD值低于 0.700时，可判定为阴性（此时敏感性 大于 94.1%），支持排除 NPC，但应建议病人定期复查； 当普查时，绝大部分人均非鼻咽癌患者，因此特异性为 主要的诊断参数。推荐使用当 rOD值高于 1.500时，可判 定为阳性（此时特异性大于 94.4%），即高度怀疑病人患 有 NPC，应继续进行组织

15、学检查以确诊。 当 rOD值在 0.700至 1.500之间时，判定为可疑 NPC（此时 敏感性和特异性在 70%95%之间），须结合临床作进一 步检查和随访，必要时进行组织学检查。 3、 本品的判断依据和评价 相对抗体水平与罹患 NPC的关系 ： 对 1402例 1998年以来在 NPC高发区普通门 诊和耳鼻喉科就诊病人的血清进行检测 ， 其相 对抗体水平 （ rOD） 与罹患 NPC的关系见下表 。 1402例病人中有 321例经组织学检查确诊为 NPC， 其他 1081例临床经多种血清学方法或组 织学方法检查 ， 结合临床观察 ， 不能确诊为 NPC， 应考虑排除 NPC。 表 NPC高

16、发区 1402例疑似病人相对抗体水平与罹患 NPC的关系 rOD % 敏感性 % 特异性 阳性试验似然 比（ LR） 0.200 99.7 (320/321) 8.0 (86/1081) 1.1 0.400 98.1 (315/321) 38.6 (417/1081) 1.6 0.600 94.7 (304/321) 62.6 (677/1081) 2.5 0.700 94.1 (302/321) 70.1 (758/1081) 3.1 0.800 90.0 (289/321) 76.3 (825/1081) 3.8 1.000 85.0 (273/321) 84.4 (912/1081) 5

17、.4 1.300 76.0 (244/321) 91.5 (989/1081) 8.9 1.500 69.2 (222/321) 94.4 (1021/1081) 12.5 1.600 63.6 (204/321) 95.9 (1037/1081) 15.6 1.800 57.9 (186/321) 97.4 (1053/1081) 22.4 2.000 47.7 (153/321) 98.1 (1061/1081) 25.8 注：阳性试验似然比（ LR） = 敏感性 ( 1特异性 ) EBNA1-IgA ELISA 检测结果的最优化选择 EB N A 1 -I g A 0 10 20 30

18、40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 特异度 controls 敏感度 NPC 低 / 高 rOD值 百分比 临床考核 试验评价（ 1） 三个医疗单位的非鼻咽癌个体的抗体水平相似，并且明显 低于鼻咽癌患者的抗体水平。详见下表 鼻咽癌患者抗体 中位数水平 非鼻咽癌个体抗 体 中位数水平 玛丽医院 2.1 rOD 0.56 rOD 东莞市人民医院 1.8 rOD 0.67 rOD 中山市肿瘤研究所 1.9 rOD 0.63 rOD 综合 1.9 rOD 0.63 rOD 临床考核 试验评价（ 2） 三个医疗单位的检测中，敏感性和特异性的水平相似。详见下表 界限值 = 0.

19、7 rOD 界限值 = 1.5 rOD 灵敏度 特异性 灵敏度 特异性 玛丽医院 93% 77% 77% 95% 东莞市人民医院 94% 70% 63% 94% 中山市肿瘤研究所 96% 68% 68% 94% 综合 94% 69% 66% 94% 临床考核 试验评价（ 3） 进行了 VCA IgA 和 EA IgA的免疫荧光检测以及 EBV DNA检测对比 。 作为筛查实验排除鼻咽癌的应用与 VCA IgA相比较 VCA IgA 界值 0.7 rOD 阴性预测率 94% 97% 假阴性率 13% 7% 被排除的疑似 鼻咽癌病例 59% 77% 作为确定实验预测鼻咽癌的应用与 EA IgA 和

20、 EBV DNA检测相比较 EA IgA EBV DNA 界值 1.5 rOD 阳性预测率 86% 89% 83% 假阳性率 4% 2% 5% 被预测的疑似鼻咽癌病例 75% 57% 77% 结果表明，本品在筛查试验中的应用与目前所使用的 VCA IgA相似， 在确定实验中的应用与目前所使用的 EA IgA，或与最新使用的 EBV DNA检测相似。 小结 临床考核检测 441例鼻咽癌患者， 1523例非鼻咽癌患 者。考核结果显示： 以 R 0.7为临界值 （ 与目前所使用的 VCA IgA相 似 ） ，本品检测阴性符合率为 94%。假阴性率为 6%； 特异性为 69%，假阳性 31%。 以 R

21、 1.5为 临界值（ 与目前所使用的 EA IgA ）， 本品检测的阳性符合率为 66%，假阳性率为 6%，特 异性 94%，假阴性 34%。 上述结果与本品的使用说明书推荐使用的 诊断参数及其临床意义相一致。 中国药品生物制品检定所药品注册检验报告 检品名称及批号 EB病毒 IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒 批号： 20040612 检验项目 标准规定 检验结果 物理检查 液体组份应为澄清液体 符合规定 阳性参考品符合率： 阳性参考品 20份 阳性参考品符合率为 19/20 19/20 阴性参考品符合率： 阴性参考品 20份 阴性参考品符合率为 19/20 19/20 精密性（ %） 精密

22、性参考品 n=10 CV15% 2 检验结论 符合规定 报告编号： SZ200501144 签发日期： 2005年 3月 29日 中国药品生物制品检定所药品注册检验报告 检品名称及批号 EB病毒 IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒 批号： 20040619 检验项目 标准规定 检验结果 物理检查 液体组份应为澄清液体 符合规定 阳性参考品符合率： 阳性参考品 20份 阳性参考品符合率为 19/20 19/20 阴性参考品符合率： 阴性参考品 20份 阴性参考品符合率为 19/20 19/20 精密性（ %） 精密性参考品 n=10 CV15% 8 检验结论 符合规定 报告编号： SZ200501145 签发日期： 2005年 3月 29日 中国药品生物制品检定所药品注册检验报告 检品名称及批号 EB病毒 IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒 批号： 20040626 检验项目 标准规定 检验结果 物理检查 液体组份应为澄清液体 符合规定 阳性参考品符合率： 阳性参考品 20份 阳性参考品符合率为 19/20 19/20 阴性参考品符合率： 阴性参考品 20份 阴性参考品符合率为 19/20 19/20 精密性（ %） 精密性参考品 n=10 CV15% 3 检验结论 符合规定 报告编号： SZ200501146 签发日期： 2005年 3月 29日 谢 谢