豆目植物根瘤菌剂的生产及应用

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1、豆科植物根瘤菌剂优良菌种选育及应用效果研究综述康文娟草业学院草地生物多样性摘要：本文对自然选育、杂交选育、诱变选育、原生质体融合选育、基因工程选育等有关根瘤菌剂优良菌株选 育的方法手段以及国内外研究进展等方面进行综述，讨论认为：如何筛选到高效固氮的根瘤菌株，是提高根瘤菌应 用效果面临的关键问题，并针对我国根瘤菌剂产业起始阶段发酵水平低、保质期短、技术不成熟、质量不过关以 及传统种植模式、农户知识缺乏、政府重视程度等问题提出大面积应用与推广的展望。关键词：豆科植物；根瘤菌；菌株筛选；应用效果生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一，它在生产实际中发挥着重要作 用1而豆科植物与根瘤菌的共生固氮，

2、因具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强 的优点，一直是生物固氮研究的焦点。据统计，我国拥有的豆科植物约为690属，17600 余种，具有极大的经济及社会价值。根瘤菌剂最早于1896年在欧洲问世，是指以根瘤 菌为生产菌种制成的微生物制剂产品，它能够固定空气中的氮元素，为宿主植物提供 大量氮肥，从而达到增产的目的，在多年不种绿肥或新开垦地种植豆科绿肥时接种根 瘤菌，能确保豆科绿肥生长良好。国际上对豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多年的历史。但关于根瘤菌选育的方 法与进展，国内外的系统报道仍然较少。就目前的情况看，要想提高根瘤菌的应用效 果面临的关键问题是：如何筛选到高效固氮的根瘤菌株，以进一步提高根

3、瘤菌菌种的 固氮效能、结瘤能力和竞争抗逆能力等。为此，开展根瘤菌高效菌株的选育研究工作 是 极为必要。本文紧紧围绕根瘤菌选育问题，对有关根瘤菌选育的方法手段以及国内 外研究进展进行总结归纳和分析，讨论当前存在的问题并提出本领域进一步研究的发 展趋向，以期对筛选高效根瘤菌的研究提供理论和方法依据。1根瘤菌剂优良菌种选育根瘤菌优良菌种的选育是20世纪末以来根瘤菌研究的热点，随着人类环境意识 和农业高效栽培关键技术应用意识的增强，生物肥料的作用越来越受到各国政府和市 场的重视。当代生物技术的发展也为根瘤菌优良菌种的选育研究提供了良好的技术手 段和理论依据。豆科植物与根瘤菌之间的共生结瘤是一个由双方有

4、关基因共同参与相 互识别协同作用，并能随环境条件和细胞内的生理状态变化而调节的复杂过程，最终 在宿主植物根部形成能够固氮的根瘤。根瘤菌与寄主品种之间只有很好搭配才能使 豆科植物获得最佳的固氮效果。因此，特定豆科植物品种优良菌种的选育及匹配至关 重要。一般而言，所选择的菌株需具有如下指标：与相应宿主迅速形成有效根瘤；在 各种田间条件下，有迅速有效结瘤能力；与土壤中土著根瘤菌的竞争能力；在无宿主 条件下存活的能力，在载体机质中的生长能力；在载体里和种子上的存活能力；对p H和接触化肥、农药的耐受能力；在培养基中的遗传稳定性。因此为了充分发挥根瘤 菌在生产上的应用，要求筛选的菌株不仅有效性高而且竞争

5、性强%。目前，对高效优 良菌种的选育主要有以下几种方法： 1.1自然选育这是一种最基础也是目前运用得最为广泛的菌种选育方法，其实质是利用自然界 中丰富的豆科根瘤菌菌种资源，将自然条件下存在于植物中的各种优良根瘤菌种进行 搜集整理和利用。由于根瘤菌内的宿主专一性基因只存在于某些根瘤菌种内囹，因 此，目的豆科植物的根瘤菌菌剂的菌种可以从该植物根瘤中直接分离而来。在发展根 瘤菌剂生产过程中，各国都建立了高效根瘤菌菌株筛选的基本程序，即实验室-温室 -田间或分离-初筛-复筛等程序。具体的分离方法有平板划线法和稀释涂布法，其 中平板划线法使用较多，通过多次的分离纯化得到纯的单菌落，然后结合所分离菌种 的

6、各种理化指标利用PCR-RFLP分析16SrDNA、nifD-K间隔法对初步分离的根瘤 菌进行鉴定。陈文新6等从在全国32个省(市)700个县不同生态环境中的近600种豆 科植物上分离了 10000多株根瘤菌，发现并发表根瘤菌新属2个，新种30个，占国 际根瘤菌属种的1/3强；研究人员从Bradyrhizobium japonici分离到高效固氮酶突 变菌体，这种突变株比野生型菌株有高1倍的固氮酶活力。在美国加州进行的大田 实验表明，接种这些突变株能使大豆提高产量12 % ( W i l l i a m s )；常玮7等根据 新疆气候特点，从土壤中分离筛选出了一株在耐旱、耐盐碱方面抗性较强的苜

7、蓿根瘤 菌 Rhizobium sp.XJ67。由于人工选择不能改变个体的基因型，而只是积累并利用自然条件下发生的有 益变异。所以要使选择育种产生效果需要广泛收集不同地域、不同生态型的菌株 以 便从大量菌株中去粗取精、弃劣留优，筛选到适合人们需要的菌株。这种方法工作量 大、筛选程序复杂，但是可以有效选育出性能稳定的高产菌株，该方法在国内外应用 广泛，仍然是目前筛选高效根瘤菌的基础方法。1.2杂交选育杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交 和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中 的一种育种技术1。通过杂交育种可以实现不同的遗传性

8、状的菌株间杂交，使遗传物 质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，获得新的品种。 根瘤菌的杂交选育是用特异性不同的根瘤菌株在固体培养基上混合培养后，经多次 移接从中获得新菌株的方法，这个方法是2 0世纪5 0年代由胡济生等创立，他们用 此法获得了 104 6菌株，应用于生产。杂交育种在真核生物育种上发挥了重要的作用，但是该过程需要进行多次移接 和筛选，较为繁琐，目的性不强，目前有关运用传统的杂交手段选育根瘤菌的工作报 道很少，报道较多的是由质粒介导进行杂交，由此转向了基因工程育种，该方法在根 瘤菌选育方面与其他育种手段相比没有优势，基本上被取代。1.3诱变选育这是一种利用物

9、理化学或生物诱变因子对目的微生物基因组进行处理，从而得到 所需优良菌种的技术。对根瘤菌的诱变育种方面，国内外学者在诱变和筛选方面做了 大量的研究，已取得了不少成果。1.3.1物理诱变常用的物理诱变方法有紫外诱变和激光诱变。在物理诱变剂中，紫外线是一种 使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂。而其他几种射线都是电离性质 的，具有很强的穿透力。李元芳和刘惠琴9以大豆根瘤菌005和2028菌株为出发菌株, 经适当紫外线照射后得到变异菌株固氮酶活性分别提高了 150 %和214 . 4 %；赵志 山、魏宝杰10等利用快中子对小金黄大豆根瘤菌进行不同剂量的照射，经诱变处理的 根瘤菌侵染大豆后，每

10、一组的株十重、结瘤数都高于对照组，株十重最高者为对照组 的15倍左右，结瘤数最高者为对照组的9.5倍；处理后的根瘤菌固氮活力有不同的变 化，株固氮能力为对照组的60倍左右；陈今朝、张红11等用紫外线照射四季豆根瘤菌 (R. Phaseoli)、豌豆根瘤菌(R. Leguminosarm )和花生根瘤菌(R.Peanut )，然后观察其 形态特征，并将不同形态特征菌落的菌株接种于不同pH值YEM培养基和不同NaCl 浓度的YEM培养基上培养，发现突变株的抗酸碱性和抗盐性随根瘤菌不同而异，并与 其菌落形态有关。激光诱变育种在国内有很大发展，黄怀琼12以苕子根瘤菌株004、006为出发菌 株，经CO

11、2激光辐照处理菌悬液，采用富集培养方法，分离出诱变菌株，通过结瘤筛 选和盆栽试验选出结瘤和固氮能力强的4 - 00 4、1- 00 6 CO2激光诱变菌株；用慢生 型花生根瘤菌株0 1、q分别采用N2激光和CO2激光处理，获得N2- 01、CO2- 5诱变 菌株，它们的感染力和结瘤性能均优于原菌株，植株干重及含氮量增加，抗逆性强； 王成文、曾级芳13等用N2激光、He -Ne激光、CO2激光为诱变源，用激光辐照与杂交 结合的方法对根瘤菌进行诱变育种.提高了远缘杂交效率、克服了获得远缘杂种的首 要障碍。传统的理化因子对微生物的诱变作用强烈，但正变率低，诱变株的遗传稳定性较 差，易发生回复突变，经

12、过长期累积处理的菌种，再用相同的诱变处理，常出现饱和 现象，处理效果不理想。近年发展起来的微波诱变凭借其较为稳定的诱变效果及较高 的有力突变率正逐步成为物理诱变法中不可忽视的新兴力量。1.3.2化学诱变在化学诱变中，常用的诱变剂是亚硝基胍(NTG )，它是一种极强的诱变和致癌 剂，近年来采用亚硝基胍诱变方法已经获得了高效固氮的大豆根瘤菌。张宪武等用亚 硝基胍等方法诱变得到大豆根瘤菌突变株(B16- 1 1)，它具有自生固氮能力,在实验 室条件下能使乙炔还原为乙烯，固氮活性较野生型菌株(B16)高3倍以上;曹燕珍、 李享棣14用NTG诱变紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)A

13、2 1，结果表明NTG对 紫云英根瘤菌的感染力有明显影响，高浓度NTG有明显的正变效果。随着浓度的提 高,菌株感染力有增强的趋势。用1000微克/毫升的NTG处理紫云英根瘤菌后，不仅结 瘤菌株数提高，而且现瘤时间大大提前，最快的只要6天，比对照提前4天。另外吖啶橙 (acridine orange，AO )能在细菌中诱发大量的移码突变，龙敏南等通过吖啶橙诱变花 生根瘤菌，筛选出能使大豆结瘤并具吸H2和固氮活性的花生根瘤菌变株。比起物理诱变，化学诱变剂的突变率通常要比较高，并且十分经济，但由于它们 多是引起碱基置换突变，易发生回变,导致变异不稳定，突变株分离和检测困难，另 外这些物质大多是强致癌

14、剂，使用时必须十分谨慎，对实验条件也有较高的要求。在 化学诱变中，目前仍然没有新型诱变剂的出现，其通常和多种诱变技术相结合的复合 诱变广泛用于根瘤菌选育研究中。1.3.3生物诱变生物诱变主要是利用营养缺陷型菌株的回复突变来选育出具有高效结瘤固氮能 力的根瘤菌戚16】。根瘤菌的色氨酸代谢也受到不少研究者的重视。W e l l s S E和 Kuykendall LD采用亚硝酸诱变的方法筛选到慢生型大豆根瘤I- 11OR S的11株色 氨酸营养缺陷型，它们均失去了结瘤或固氮能力，但是其回复突变的原养型菌株仍能感 染植物并形成有效根瘤。Hunter WJ和Kuykendall LD研究了慢生型大豆根

15、瘤菌色氨 酸回复原养突变型的共生效应，从中筛选到了 1株具有高效共生固氮作用的菌株 TAll-Nod+。用该菌接种的植株干重和全氮量均较野生型出发菌株有显著提高,其结 瘤率也比接种野生型出发菌的提高56 % 17,18。目前尚不清楚这一提高结瘤率和固氮 能力的机理，推测TA l l - N o d+菌株可能提供了浓度更适合于形成有效根瘤的物质。 营养缺陷型突变株的回复突变的研究对根瘤菌的选育提供了一个新的思路。1.4原生质体融合选育原生质体融合技术可以根据需要有目的的选择菌株进行融合，得到较为理想的融 合体。韦革宏等以青霉素和氯霉素分别作为Rhizobium leguminosorum USD

16、A2370和 Sinorhizobium xinjiangnesis CCBAUll0的抗药性标记19。利用原生质体融合技术，成 功地获得了 USDA2370和CCBAUll0的属间融合菌株。该融合菌株可分别在双亲寄 主植物上结瘤20；朱铭莪等利用原生质体融合技术,链霉素和青霉素分别作为苜蓿 中华根瘤菌(Sinorhizobium melilot ) 102F28和鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri) USDA 3383的抗药性选择标记，成功地获得102F28和USDA3383的属间融合 子，该融合子可分别在双亲寄主植物上结瘤21；王媛媛以大豆胞囊线虫和大豆根腐病 菌

17、为靶标，从大豆根瘤中分离筛选出对两种病原具有拮抗生物活性的根瘤菌和芽孢杆 菌，利用细胞融合技术将根瘤菌和芽孢杆菌迸行融合，筛选出了集固氮促生和拮抗性 能力为一体的根瘤菌工程菌株22。原生质体融合技术由于遗传信息传递量大，不需了解双亲详细的遗传背景，可有 目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，为遗传育种提供了一种有效 手段，但该技术中原生质体的制备和再生对环境依赖很大，因此使其广泛应用受到了 一定的限制，国内外通过融合技术获得高效固氮能力根瘤菌的相关报道不是很多。 1.5基因工程选育基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌， 或者是通过微生物间的转基因而获得

18、新菌种的育种方法。利用基因工程选育高效结瘤 固氮的根瘤菌是目前使用得最为广泛的方法，它可以克服菌种间远缘杂交不亲和的现 象，有效地提高菌种的结瘤和固氮性能。BirkenheadK剖等将含有苜蓿根瘤菌dct 基因的重组质粒 pRK 290 :4:4 b导入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum ) CJ1，不仅在好气自生条件下提高了转移接合子CJ1( pRK 29 0 : 4 : 4 b ) 的琥珀酸转运能力，而且在微氧条件下使转移接合子的固氮酶活性较出发菌株CJ1提 高了 60 %;谢波,陈大松25等构建出了费氏中华根瘤菌嘌吟合成酶基因purL的基因置 换载体pHN7

19、0l，用luxAB基因取代purL内部的not I-Xho I片段，造成正常基因的破 坏。然后用该载体对野生型费氏中华根瘤菌HHl03进行purL基因置换，筛选到腺嘌 吟缺陷型突变株P825。purL表达载体pBBR-PG在P825中可恢复其在亲本基本培养 基上的生长情况，证明突变株确实为purL单基因破坏。盆栽结瘤实验结果表明，该 突变株只能侵染大豆根系形成不固氮的根瘸;李海英，张喜波26 等以快生型大豆根瘤 茵(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA为模板，采用PCR技术，克隆固氮基因 nifA全长；将其连入带有lac启动子下游，构建带有LuxAB基因标记的表达

20、载体 pTRl02，采用三亲本杂交技术转化土著大豆根瘤茵中，构建了大豆根瘤菌工程菌株; 刘金玲，贾珊珊27等以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA 为模板，采用PCR技术克隆结瘤基因nod D编码区序列，并利用DNA重组技术，将 nod D基因连到lac启动子的下游，通过lux AB基因标记的质粒栽体pTRl02构建表 达栽体pTRl02-Plac-nod D，采用三亲本杂交的方式，将构建的表达栽体转化到土著 大豆根瘤菌，构建了转基因工程菌株。目前国外最成功的例子是利用dct BA、dc t B、d ct C和n i f A基因构建的重 组苜蓿根

21、瘤菌菌株R M PBC - 2 ,美国环境保护署(EP A )批准其进行商品化生产， 这也是目前世界上惟一 1株通过了遗传工程菌安全性评价并进入有限商品化生产的 重组根瘤菌菌株28，29。在863 计划支持下，我国一些科学家也开始尝试通过基因 工程的方法构建具有高效结瘤、固氮能力的重组根瘤菌，并取得了一些进展19。目 前我国境内已有申报并获准中间实验的重组根瘤菌，如：中国农业大学生命科学学院 的转基因重组大豆根瘤菌；中科院植物生理研究所的重组大豆根瘤菌的中间实验；广 西大学的转基因重组大豆根瘤菌环境释放；中科院植物生理研究所的重组苜蓿根瘤 菌在河北、新疆的中间实验30。基因工程育种是真正意义上

22、的理性选育，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有 前途的一种育种新技术。但是，在根瘤菌选育中应用分子生物学技术依然受到各种现 实条件的限制，如研究中的巨额耗费，微生物背景知识的匮乏，以及技术门槛较高等 原因都防碍了现代生物技术在根瘤菌选育中的应用。2根瘤菌剂的应用根瘤菌菌剂作为一种有效提高豆科植物产量的微生物菌剂，在全世界范围内得到 了较为全面的开发应用。自1895年首次在德国出现了以Nitragin为商品名的根瘤菌 接种剂以来，前苏联英国美国和法国等相继实现了根瘤菌剂的工业化生产和大面积推 广声。目前，在美国、阿根廷、巴西等世界主要大豆生产国，大豆根瘤菌剂的应用面 积一般都占播种面积的30%6

23、0%，有的国家甚至达到100%。我国根瘤菌剂的研究从20世纪30年代开始。用优良菌株制备的根瘤菌剂接种与 其匹配的特定豆科植物后，才可能提高感染和结瘤率，促进生长，获得了显著的增产 效果。吴显峰31 应用富思德大豆根瘤菌剂接种大豆，结果表明：应用富思德大豆根 瘤菌剂拌种处理比未用根瘤菌剂拌种处理产量增加13%，效益增加18%，大大减少 化肥施用量。人工接种根瘤菌的紫花苜蓿比对照早结瘤、多结瘤，成苗率有所提高， 植株高度、分枝数都优于不接种的对照。据黑龙江、辽宁、内蒙古和江西4省区18 个试验点，在紫花苜蓿幼苗60龄时调查，接种区植株高度平均比对照增加16%。在 18个紫花苜蓿播种区调查结果表明

24、，在紫花苜蓿播种当年第一次割草测产中，接种 区产草量比对照区提高37.8%，每公顷增产十草527kg32。研究表明接种“富思德” 苜蓿根瘤菌剂明显改善了公农1号紫花苜蓿的结瘤。接种根瘤菌后，紫花苜蓿结瘤率 提高42.491.7%，单株根瘤数增加56.4181.1 %，单株根瘤重增加69.7166.5%。 接种根瘤菌增加了紫花苜蓿的分枝数，提高了紫花苜蓿的生长速度，使十草产量增加 12.918.6%，比较各接菌水平，以接菌4.5 kg / hm2效果最好E。根瘤菌处理紫云 英后，无论是结瘤率、根瘤重还是干草产量和籽粒产量均较对照有明显的增加34。为了提高根瘤菌剂的固氮效果，目前又生产一种新型根瘤

25、菌剂一稀土菌剂。这种 含有0.1%稀土化合物的根瘤菌剂，它能增强根瘤菌的存活率和对寄主作物的侵染结 瘤能力，其增产效果高于一般根瘤菌剂。刘彦江，胡汉民35等研究表明施用根瘤菌剂 和稀土肥料能促进苜蓿生长提高植株高度，两者配合效果优于单施，其中以根瘤菌种 衣剂+全元稀土微肥+活性稀土微肥效果最好。另外使用根瘤菌剂不仅可以增加豆科 植物的产量，而且由于根瘤菌剂耐污染能力强，可以减少因长期使用化肥对土壤造成 的破坏水源污染节省能源和改善土壤生态环境等。目前我国共生固氮的基础研究已达到国际先进水平，然而由于我国根瘤菌剂产业 起始阶段发酵水平低、保质期短和技术不成熟质量不过关等问题，根瘤菌剂的推广效 果

26、一直不理想，虽然我国大豆种植约800万hm2,但是我国大豆根瘤菌接种面积尚不 足3%，与大豆生产大国相比差距甚大33。并且由于存在竞争性能不如土著根瘤菌菌 剂，施用广谱性能不佳，菌剂施用存在地域和环境差异等缺点，加之受到传统种植模 式，农户知识缺乏，商家经营理念及政府重视程度和投入力度等影响，使根瘤菌剂的 进一步开发和大面积推广应用受到限制。3展望基于目前根瘤菌选育和应用效果的研究现状，从以下两个方面提出展望：3.1优良根瘤菌筛选方面以DNA分子克隆和表达技术为主要工具的基因工程技术是现代生物技术的主体, 它成为微生物菌种选育的主要研究方向之一，生物固氮研究者需要构建越来越多的 竞争结瘤能力和

27、共生固氮效率显著提高的基因工程菌株。同时在根瘤菌的菌种选育过 程中，传统的自然选育方法依然占据重要的地位，它是开发高效根瘤菌的基础。在诱 变育种方面开发一些操作简单、安全，而且正变率高、辐射损伤轻的新型诱变因子，这 些新型诱变技术会极大推进根瘤菌选育工作。根瘤菌与植物的共生固氮过程是十分复杂的，有关共生固氮基因的定位、表达和 调控等机理还没有完全被认识，许多工作仍被视为探索性的实验，因此，加强对根瘤 菌与植物之间共生固氮的机理的研究，并且开发和建立高效根瘤菌的筛选技术，缩短 育种周期和降低成本，提高筛选效率，都将会大大促进根瘤菌选育工作。3.2根瘤菌的应用方面加大根瘤菌剂的研发技术如发酵技术、

28、菌种保存及菌剂类型等方面的研究，争取 根瘤菌剂产业化和扩大根瘤菌剂的应用范围，为农林业的发展提供有力保证；加大基 础研究，提高菌剂根瘤菌的竞争及结瘤能力；重视相关技术的利用，增加菌剂的广谱 性能，增强菌种对地域和各种环境的适应能力，为根瘤菌剂的大规模生产和使用提供 技术支持；以试验示范为基础，以宣传培训为重要手段，改变农户传统种植观念，推 行新的农技推广模式；国家应给予政策支持，加大研发和推广经费投入，为高效根瘤 菌剂的制备和推广提供政策支撑;根瘤菌剂市场的发展对氮肥产业有所冲击，建议化 肥产业改变现有产品结构，向环保节能型方向转化。参考文献1 范运梁，刘雪，戴美学.根瘤菌选育研究进展J.生物

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