酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力

《酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力（9页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力李丹;赵新淮 【摘要】利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)对酪蛋白进行限制性脱酰胺和水解处理，以 SDS-PAGE及排阻色谱分析评价产物的蛋白质降解情况，并制备具有较低脱酰胺度 的脱酰胺酪蛋白产物.在酪蛋白质量浓度为5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋 白、37的条件下分别反应6 h、12 h和24 h,制得脱酰胺度分别为2.8%、5.8% 和8.5%,水解度分别为2.5%、3.4%和 4.9%的脱酰胺酪蛋白.评价这3种脱酰胺酪 蛋白产物对Fe2+和Ca2+的螯合能力，结果表明,脱酰胺酪蛋白产物对Fe2+和 Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，

2、并随着脱酰胺度的增加而提高.【期刊名称】食品与发酵工业 【年(卷)，期】2010(036)011 【总页数】5页(P21-25) 【关键词】谷氨酰胺酶;酪蛋白;脱酰胺;螯合能力;铁;钙 【作者】李丹;赵新淮【作者单位】东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030【正文语种】中文 食品蛋白质经过特定的修饰会改变其相应性质，如酶法水解既能获得具有生物活性的肽1，又可提高食品蛋白质的功能性质2。酶处理方法的反应条件相对 温和，一般不会导致有毒物质的产生。食品蛋白质经过脱酰胺作用后，能够改善一 些功能性质，因此具

3、有潜在的食品加工应用价值3。例如，燕麦分离蛋白经脱 酰胺处理后溶解性、乳化性等功能性质均有显著增强4。对小麦蛋白进行脱酰 胺作用，结果表明，中性pH条件下脱酰胺小麦蛋白的溶解性及乳化性质有显著的 提高5。另外，蛋白质水解产物对一些矿物质元素（如Fe2+和Ca2+）有较好的 螯合作用，可以作为配体来提高矿物质的溶解性，提高矿物质的生物利用率6。 Kumagai等7发现，去肌醇六磷酸大豆球蛋白经脱酰胺后对Ca2+的螯合能力， 相比大豆球蛋白以及去肌醇六磷酸大豆球蛋白对Ca2+的螯合能力都有所增强。研 究还发现，即使经消化酶作用后，去肌醇六磷酸脱酰胺大豆球蛋白仍具有较高的 Ca2+螯合能力，并且脱酰

4、胺大豆球蛋白及其水解产物显著提高小肠对Ca2+的吸 收利用率8。本研究利用谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）对酪蛋白进行限制性脱酰胺，得到较低脱酰胺 度或水解度的脱酰胺产物，并对其Fe2+和Ca2+螯合能力进行评价和比较。酪蛋白（蛋白质含量93.8%）、3-（2-毗啶基）-5 , 6-双（4-苯磺酸）-1, 2,4-三嗪 （ferrozine）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2），均购自Sigma公司;标准蛋白Marker,购 自索莱宝科技有限公司;其他试剂均为分析纯试剂。UV-2401PC紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Kjeltec TM 3200全自动凯式 定氮仪，瑞士 Foss公司

5、;UVP/C8484 - 05G凝胶成像分析系统，美国UVP公 司;AKTA100蛋白纯化仪，美国GE Amersham公司;AA - 800原子吸收分光光度 计，美国Perkin Elmer公司。配制质量浓度为10%酪蛋白溶液，并用0.2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。 配制0.01 g/mL谷氨酰胺酶溶液（现用现配），将一定量的酪蛋白溶液与超纯水、不 同体积的谷氨酰胺酶溶液混合，配制成酪蛋白质量浓度为5%、酶添加量分别为 100、400、700 U/kg酪蛋白的反应体系。反应体系在37下酶解6-36 h,按 照以下方法分别测定产物的脱酰胺度及水解度。以未加谷氨酰胺酶溶液的酪蛋白溶

6、 液为空白。1.3.2.1蛋白质含量、脱酰胺度以及水解度的测定(1) 蛋白质含量:凯氏定氮法9。(2) 脱酰胺度测定:苯酚-次氯酸盐法10。反应结束后，取反应液2mL置于离心管中，并立即加入2mL质量分数为12%的 三氯乙酸终止反应，12 000 r/min离心10 min除去沉淀，上清液待测。试剂氏分取5.0 g苯酚、25 mg亚硝基铁氰化钠，溶于双蒸水中，定容至500mL。 试剂B:取2.5 g NaOH溶于双蒸水中，加入4.2mL的质量浓度为6.5%的次氯酸 钠溶液，定容至500mL。试剂A和试剂B均置于棕色试剂瓶中，4C冰箱中储存 备用。移取5.0mL试剂A于试管中，加入20pL样品溶

7、液(或20pL双蒸水)，充分振荡、 混匀。移取5.0mL试剂B加入到上述混合溶液中，充分振荡、混匀37C水浴中 反应20 min，冷却至室温，并在625 nm波长测定溶液吸光值a(或b)。以硫酸 铵标准溶液(0.21凹/时)绘制标准曲线;根据所得差值(ab)和标准曲线，计算样品 中游离氨浓度。称取一定量的酪蛋白，置入水解管，然后加入5mL终浓度为3mol/L的H2SO4 , 用酒精喷灯密封水解管，110C下水解24 h。水解完毕后，将水解液中和至中性 并稀释一定倍数后，按上述方法，在625 nm波长测定水解液稀释液的吸光值。根据标准曲线，计算出酪蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺残基总量。脱酰胺度计算公

8、式 如式(1)：蛋白质水解度的测定:邻苯二甲醛(OPA)法11。OPA试剂:取2.00 g十二烷基磺酸钠(SDS),加入一定量硼酸缓冲溶液(pH 9.5), 待完全溶解后，加入1mL 80mg/mL的OPA乙醇溶液、200片蔬基乙醇，最 后用硼酸缓冲溶液定容至100mL。此溶液现用现配。将样品溶液稀释至一定倍数后，取3mL样品稀释液与同体积OPA试剂混合并开 始计时，准确反应5 min，立即在分光光度计上340 nm波长处测吸光值。以亮 氨酸标准溶液（1236pg/mL）绘制标准曲线，利用标准曲线计算样品中游离氨基 浓度（pmol/mL）。水解度计算公式如式（2）:1.3.2.2 SDS-PA

9、GE 分析采用不连续垂直板状凝胶电泳，浓缩胶浓度为4%、分离胶浓度为15%。浓缩胶 和分离胶配此组成见表112。凝胶板面积120 mmx100 mm，凝胶厚度1.5 mm，上样量10。电泳时初始电压80V，待样品进入分离胶时电压增至120V;当漠酚蓝指示剂迁移到凝胶板底部时，停止电泳。剥离凝胶，加入戊二醛固定液固 定1 h。取出固定好的凝胶在染色液（含0.25%考马斯亮蓝R250、45%甲醇、10% 乙酸）中染色3-5 h,弃去染色液，加入脱色液V（甲醇）：V（冰乙酸）: V（水）=2:2:9，经常更换脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质色带 清晰为止。然后于凝胶成像系统中对各条带进行分析。

10、1.3.2.3排阻色谱分析采用Chu等人13的方法，略有改动。将酪蛋白以及脱酰胺酪蛋白产物溶于 0.2mol/L、pH值12的磷酸盐缓冲溶液中，终浓度为2mg/mL;洗脱剂为 0.2mol/L、pH值12的磷酸盐缓冲溶液。样品溶液和洗脱剂通过0.45顷 微孔滤 膜过滤，并用超声波脱气。利用美国GE Amersham公司AKTA蛋白纯化仪进行 测定。柱子型号为10 mmx300 mm、填料为Pharmacia Superdex - 75凝胶。上样量为0.5mL，压力1.80 MPa，洗脱速度0.5mL/min。蛋白质检测波长280 nm。每次进样前用洗脱流动相冲洗进样环。1.3.2.4 Fe2+

11、螯合能力测定采用Xu等人14的方法，稍有改动。准确吸取250 1mg/mL的样品溶液 （样品最终浓度为100pg/mL）直接与XpL 1 mmol/L 的 FeCl2溶液混合（最终浓度 为1060 pmol/L，此溶液现用现配)，加入一定量的超纯水使反应体系终体积为 1.5mL。混匀后放置2 min，再加入1mL 500 pmol/L的Ferrozine水溶液(终浓 度为200 pmol/L),充分振荡、混匀。混合体系在室温下静置10 min，使充分反应形成Fe2+-Ferrozine复合物，用紫外分光光度法在562 nm条件下测吸光值。 对照样中加入一定量的EDTA溶液(终浓度为10 pmo

12、l/L)o整个过程中，使用的水 为超纯水。样品对Fe2+的螯合效率计算见公式(3):式中:AT,样品吸光度;AC，对照样吸光度XpL 1 mmol/L 的 FeCl2溶液加入(2 500 -X)pL 超纯水。1.3.2.5 Ca2+螯合能力的测定采用Bao等人15 的方法，略有改动。(1) 将0.03 g样品溶解于3mL、pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液，37C水浴中放置 10 min，充分溶解后加入0.04mol/L的CaCl2溶液1mLo37C水浴中反应30 min后，6 000 r/min离心5 min，收集上清液。将上清液稀释至一定倍数，用原 子吸收光谱法测定上清液中的Ca2+含量

13、A。Ca2+螯合能力计算公式为：式中:AT,总Ca2+的量(mol);A，上清液中Ca2+的量(mol);P，蛋白质质量(g)。(2) 钙含量测定:采用空气-乙炔火焰原子吸收光谱法(FAAS法)。用质量分数为3% 的硝酸溶液将Ca2+标准储备液(国家标准物质研究中心)逐级稀释成0、2、4、6、 8.10pg/mL系列标准溶液。测定条件为:波长422.7 nm ,灯电流8 mA,狭缝 0.7 nm，乙炔流量1 L/min，空气流量4.0 L/min，燃烧器高度10 mm。测定标 准系列溶液(浓度由低到高)的Ca2+含量，仪器自动处理数据，并显示标准曲线。 确认后，按顺序进行空白和样品溶液的测定。

14、计算机给出测定结果10。采用SPSS 13.0软件对结果进行统计、分析，采用Excel 2003软件绘制图示。 研究发现，谷氨酰胺酶对酪蛋白的脱酰胺作用随酶添加量的增加而增加(如图1所 示)。在37C条件下，初始反应阶段(0 -18 h)，酪蛋白的脱酰胺度随反应时间的 延长而显著增加;反应24 h以后，酪蛋白的脱酰胺度几乎没有显著增加。因此，反 应24 h足可以完成酪蛋白的脱酰胺反应。对比酶添加量的影响，发现脱酰胺度随 着酶添加量的增加而大幅度增加。酶添加量为100 U/kg酪蛋白或者400 U/kg酪 蛋白时，酪蛋白的脱酰胺度比酶添加量为700 U/kg酪蛋白的脱酰胺度低。反应 24 h时，

15、酶添加量分别为100、400、700 U/kg酪蛋白时，酪蛋白的脱酰胺度分 别为3.9、8.5、10.2%。考虑到反应效率、酶成本等因素，在以后研究中酶添加量 选用400 U/kg酪蛋白。酪蛋白的脱酰胺度还与反应温度有关（如图2），可以看出，随着反应时间的延长， 酶添加量为400 U/kg酪蛋白时，32、37和42C进行的脱酰胺反应，只有37 下脱酰胺度最高，说明谷氨酰胺酶在37C下的脱酰胺活力最高。因此，可以初步 确定，酪蛋白脱酰胺反应的适宜反应条件为质量浓度为5%的酪蛋白溶液、反应温 度37C、酶添加量400 U/kg酪蛋白。此条件下，当反应分别进行6、12、24 h 时，酪蛋白的脱酰胺度

16、分别为2.8%、5.8%、8.5%，相应的水解度分别为2.5%、 2.4%、4.9%，这些产物是具有较低脱酰胺度的水解酪蛋白，在以后的研究中分别 称为脱酰胺酪蛋白1、2、3。通过SDS-PAGE发现，与酪蛋白相比，3种脱酰胺酪蛋白在分子质量为31.0 ku 附近的肽段几乎完全被水解（如图3所示），即谷氨酰胺酶使酪蛋白几乎完全水解成 小肽。小分子质量的肽主要分布在20.1、14.4 ku附近以及14.4 ku以下，并且随 着脱酰胺反应时间的延长，小分子质量的肽段更多。这再次说明谷氨酰胺酶对酪蛋 白除了具有脱酰胺作用外，还有一定的水解作用。酪蛋白与2个脱酰胺酪蛋白的排阻色谱分析结果如图4所示。从分

17、析结果上看，2 个脱酰胺蛋白的峰形与酪蛋白的峰形差异显著，说明酪蛋白在脱酰胺过程中几乎被 完全水解并生成分子质量更小（洗脱时间更长）的产物。这一结果也证明了 SDS- PAGE 分析结果，即谷氨酰胺酶对酪蛋白具有水解作用。以EDTA为对照样，向EDTA、酪蛋白以及脱酰胺酪蛋白溶液中加入10 60 pmol/L的Fe2+，考察它们对Fe2+的螯合能力，结果如图5A所示。脱酰胺酪蛋 白对Fe2+螯合的能力比酪蛋白、10 pmol/L的EDTA的更强（尤其是在较高Fe2 + 添加量），整体上约增加50%400%，并且脱酰胺酪蛋白螯合Fe2+的能力大小依 次为脱酰胺酪蛋白3、脱酰胺酪蛋白2、脱酰胺酪蛋

18、白1。图5B为酪蛋白以及脱 酰胺酪蛋白对Ca2+的螯合能力测定结果。脱酰胺酪蛋白1、脱酰胺酪蛋白2以及 脱酰胺酪蛋白3的Ca2+螯合能力分别为1.23、1.41、1.49 mmol/g，而酪蛋白 为1.05 mmol/g，即脱酰胺酪蛋白对Ca2+的螯合能力也是随着脱酰胺度的增加 而增强，并且都高于酪蛋白。这些结果表明，脱酰胺过程中酪蛋白的谷氨酰胺残基 转换成谷氨酸残基，因此，更多的Fe2+或Ca2+结合于脱酰胺酪蛋白。理论上， 酪蛋白中谷氨酰胺残基转换成谷氨酸残基的数量越多（即脱酰胺度越高），螯合 Fe2+或Ca2+的能力就越强。食品蛋白质具有螯合金属离子的能力，蛋白质对Ca2+和Fe2+的螯

19、合能力越强， 越能够提高元素的生物利用率，有利于机体对矿物质元素的吸收利用率。此外， Fe2+和Cu2+能够催化反应形成氧自由基，对Fe2+和Cu2+的螯合能力越强，则 蛋白质的抗氧化能力就越强。综上所述，脱酰胺酪蛋白可以作为一种很好的蛋白质 基料，并在食品加工中具有一定的潜在应用价值。谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）对酪蛋白具有脱酰胺和肽键水解作用能力。在酪蛋白质量 浓度为5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37C的最佳反应条件下，分别 反应6、12、24h制得3种脱酰胺酪蛋白，其脱酰胺度分别为2.8%、5.8%、 8.5%，水解度分别为2.5%、3.4%、4.9%。SDS-PA

20、GE以及排阻色谱分析结果证 明，谷氨酰胺酶对酪蛋白具有水解作用。分析结果表明，脱酰胺酪蛋白对Fe2+及 Ca2+的螯合能力均高于酪蛋白，且螯合能力与脱酰胺度相关。1 Iwaniak A , Dziuba J.Animal and plant proteins as precur-sors of peptides with ACE inhibitory activity-An in silico strategy of protein evaluation J .Food Technology and Biotechnology , 2009,47(4):441 - 449.2 Jamdar S

21、 N , Rajalakshmi V , Pednekar M D , et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties , antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate J .Food Chemistry , 2010 , 121(1):178 - 184.3 Haard N F.Enzymatic modification of proteins in food systems M .New York

22、:CRC Press , 2001:170 - 173.4 Ma C Y , Khanzada G.Functional properties of deamidated oat protein isolatesJ .Journal of Food Science , 1987 , 52(6):1 583 - 1 587.5 Yong Y H , Yamaguchi S , Matsumura Y.Effects of enzymatic deamidation by protein -glutaminase on structure and functional properties of

23、wheat gluten J .Journal of Agricultural and Food Chemistry , 2006 , 54(16):6 034 - 6 040.6 Miller DD.Food Chemistry(3 rd edition) M .New York:Marcel Dekker Inc , 1996:617 -649.7 Kumagai H , Ishida S , Koizumi A , et al.Preparation of phytate-removed , deamidated soybean globulins by ion exchangers a

24、nd characterizationof their calcium- binding ability J .Journal of Agricultural and Food Chemistry , 2002 , 50(1):172 - 176.8 Kumagai H , Koizumi A , Suda A , et al.Enhanced calcium absorption in the small intestine by a phytate-removed deamidated soybean globulin preparation J .Bioscience Biotechno

25、logy and Biochemistry , 2004,687):1 598 - 1 600.9 GB/T 5009.52003.食品中蛋白质的测定S.10 Weatherburn M W.Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia J. Analytical Chemistry , 1967 , 39(8):971 - 974.11 Spellman D , Mcevoy E , O Cuinn G , et al.Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey prote

26、in:Comparison of the TNBS , OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis J .International Dairy Journal , 2003 , 13(6):447 - 453.12 郭尧君.蛋白质电泳实验技术M .北京科学出版社，1999:96 - 104.13 Chu K T , NG T B.First report of a glutamine-rich antifungal peptide with immunomodulatory and antiprolif

27、erative activities from family Amaryllidaceae J .Biochemical& Biophysical Research Communications , 2004,325(1):169 - 173. 14Xu X M , Cao R Y , He L , et al.Antioxidant activity of hydrolysates derived from porcine plasma J .Journal of the Science of Food and Agriculture , 2009 , 89(11):1 897-1 903.15 Bao X L , Song M , Zhang J , et al.Calcium-binding ability of soy protein hydrolysates J .Chinese Chemical Letters , 2007 , 18(9):1 115 - 1 118.