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1、 哺乳动物胚胎体外生产技术哺乳动物胚胎体外生产技术 一、国内外研究现状一、国内外研究现状 早在100多年前就进行过体外受精尝试；1951年，精子获能现象的发现，是体外受精的里程碑；5070年代，实验动物上进行了大量研究，并取得了成功；80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等相继获得了成功，国内在90年代也在家畜上取得了成功。现已将卵母细胞体外成熟体外受精早期胚体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。二、卵巢卵母细胞的获得与体外成熟培养 （一）卵巢卵母细胞的获得1.活体卵巢上采集 母畜超排处理后，利用剖
2、腹术或腹腔镜技术已能成功地采集卵泡卵母细胞。2.屠宰后卵巢上采集(1)卵巢的采集与保存:宰后立即无菌采集,30-37度灭菌生理盐水中6H内运回实验室。(2)卵巢表面卵泡细胞的获得 1)抽取法:18号针头;最常用;2)剥离法:3)切开法:3.卵巢内卵泡卵母细胞的获得 数量多，用一组特制刀片对卵巢组织进行深部切割，采卵率约提高1倍。（二）卵母细胞的筛选 只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。（三）卵母细胞的体外成熟培养（三）卵母细胞的体外成熟培养1.成熟培养液与培养条件 最常用的是碳酸氢钠或Hepes缓冲的TCM-19
3、9;5%CO2、饱和湿度、38.5-39度，24H。2.成熟培养中添加成分的影响1)促性腺激素与E2的影响2)EGF的影响3)颗粒细胞的影响:低浓度能促进成熟分裂4)血清的影响 三、牛精子的体外获能与体外受精 （一）精子的洗涤与体外获能1.BO液类 鲜精或冻精解冻后离心洗涤约2次,每次5-10分钟,最后的精子小滴悬浮成1-10X 106/ML。常用咖啡因-肝素-BSA使精子获能。2.改良改良Tyrode液（液（TALP）类类 1）上浮法）上浮法 2）Percoll法法 （二）体外授精 授精通常在覆盖下的微滴中进行，微滴以50-100微升为宜，一般每滴中加5-10个卵母细胞，精子最终浓度为0.6
4、4-1X106个/ML 5%CO2、39度培养，BO液中6-8H，TALP液中18-24H。四、其它哺乳动物精子的体四、其它哺乳动物精子的体外获能与体外受精特点外获能与体外受精特点（一）猪 鲜精或冻精用0.9%氯化钠-1mg/ml BSA洗3次，然后用改良台氏液或TCM-199液稀释至108个/ml、5%CO2、39度获能孵育60min，最后在受精液（2-10mM咖啡因、10mg/ml BSA）中授精，精子最终浓度为 105 个/ml，条件为5%CO2、39度培养4-5h。（二）山羊（二）山羊Hanada等用钙离子载体法获能，受精率达50%，获得了世界首例试管山羊。刘灵等用肝素和BSA获能，受
5、精率最高达89.7%，并获得了世界首例卵泡卵母细胞体外受精后代。（三）绵羊（三）绵羊 方法与牛相似。五、早期胚的体外发育五、早期胚的体外发育 不同的动物早期胚胎体外发育不同的动物早期胚胎体外发育都存在阻断期，体外发育培养时都存在阻断期，体外发育培养时需要一些特殊的培养条件如共同需要一些特殊的培养条件如共同培养细胞，以克服阻断，但目前培养细胞，以克服阻断，但目前的发育率仍然比较低，约为的发育率仍然比较低，约为40%，是限制体外受精应用的一个突出是限制体外受精应用的一个突出问题。问题。六、胚胎冷冻保存六、胚胎冷冻保存（一）常规的慢速冷冻法（一）常规的慢速冷冻法 冷冻液 1.5M甘油+0.25M蔗糖
6、+PBSS液+0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP冷冻步骤为：在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；装管；以每分钟0.30.5的速度降温至35；植冰；平衡10分钟后，投入液氮中保存。（二）玻璃化冷冻（二）玻璃化冷冻冷冻液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS冷冻步骤：首先将胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min后，用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min，然后装管，封口。把细管直接投入液氮冷冻保存。七、影响体外受精的因素七、影响体外受精的因素（一）卵母细胞的成熟度（一）卵母细胞的成熟度（二）精子体外获能（二）精子体外获能 （三）公畜的影响（三）公畜的影响
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