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1、一 目的要求：1、学习并初步掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。3、掌握油镜原理及使用方法。二 基本原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是：1、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染实验一 革兰氏染色及油镜的使用 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。Gram stain of Gram-Gram stain of Gram+细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和
2、结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。油镜原理及说明 微生物是个体微小、结构简
3、单、肉眼无法看到的微小生命体。因此，我们要借助显微镜来进行观察。显微镜的种类很多，但基本构造可分为两大部分：一是机械装置，二是光学系统。（下面以普通光学显微镜为例）。1、机械装置由镜座、镜臂、镜筒与物镜转移器、载物台、移动器粗细调节器组成。2光学系统由目镜、物镜、聚光镜、反光镜、光圈组成。（1）目镜：装在镜筒的上端，一般各有8x、10 x、15x、16x等种不同的放大倍数的目镜。目镜只能把物镜成的像再次放大，没有辨析能力。（2）物镜：显微镜的物镜是由一组特殊的透镜组成。一般有低倍镜（10 x）、高倍镜（40 x）和油镜（100 x），它们各有一定的放大率，不仅可以放大标本，而且有辨析能力。低倍
4、镜：它的视野的实际范围最大，易于发现目标，但不易看清微生物个体的形态。高倍镜：高倍镜视野的实际范围较低倍镜小些。可以看清个体较大的微生物个体或菌丝体形态，但个体较小的微生物以及其内含物和特殊结构也无法辨清。油镜：一般在镜头上有黑圈或红圈表示的为油镜物镜，也有的以“Oil”字样表示，油镜的镜面很小，工作距离很近。使用时，在载玻片和油镜物镜之间加上一滴油（常用香柏油）（而使用低倍、高倍镜时，是隔以空气）。当光线通过载玻片时，由于玻璃与香柏油的折射率相近，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，这样就可以增加照明度，是镜检物清晰（参见表1）。表1 光线通过几种介质的折射率（n）比较：介质空气水石蜡油香
5、柏油玻璃折射率1.01.331.471.5151.52 三、器材：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 四、操作步骤：1、涂片：将大肠杆菌（24h）和金黄色葡萄球菌（24h）分别涂片、干燥、固定。2、染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1-2分钟，水洗3、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。五、实验报告：1、结果：列表简述2株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。2、思考题：1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？操作步骤操作步骤涂片涂片蒸馏水蒸馏水接种环接种环草酸铵草酸铵结晶紫结晶紫 碘碘 液液95%乙醇乙醇 沙沙 黄黄自然干燥自然干燥媒染媒染1min脱色脱色2030s固定固定初染初染1min复染复染2min干燥干燥镜检镜检
革兰氏染色及油镜的使用
