士研究课现代分子生物学PCR常见问

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1、1PCRPCR常见问题、原因分析及其对策常见问题、原因分析及其对策2PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略主讲内容主讲内容PCR技术简介技术简介3 DNA模板模板 引物引物 反应缓冲液反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶耐热聚合酶4反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响DNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCRPCR反应反应完整性完整性 模板降解会导致模板降解会导致PCRPCR扩增无产物扩增无产物浓度浓度 加量过多导致非特异性扩增增加

2、加量过多导致非特异性扩增增加特异性特异性 长度适当长度适当、避免二级结构和二聚体避免二级结构和二聚体完整性完整性 避免反复冻融避免反复冻融浓度浓度 应适当应适当,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加,过低则过低则引引 物物扩增产物太少扩增产物太少5反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响反应反应 pH值值,盐离子浓度盐离子浓度稳定剂稳定剂,增强剂增强剂Mg 2浓度浓度过高非特异性严重过高非特异性严重过低无扩增产物过低无扩增产物浓度适当浓度适当避免反复冻融避免反复冻融ddH2OpH值适当值适当避免污染避免污染6 DNA模板模板 引物引物 反应缓冲液反应缓冲液 Mg 2 dNTP

3、ddH2O 耐热聚合酶耐热聚合酶7如何选择如何选择的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求实验的不同需求8如何选择如何选择的的DNA聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性纯纯 度度稳定性稳定性酶活性酶活性9如何选择如何选择的的DNA聚合酶聚合酶 PCR 实验的不同需实验的不同需求求长片段扩增长片段扩增PCR试剂盒试剂盒 扩增效率扩增效率 保保 真真 性性 特特 异异 性性 基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测10特异性特异性 热启动热启

4、动 Taq酶酶原原 理理 蜡封蜡封 抗体抑制抗体抑制 化学修饰化学修饰特特 点点 避免非特异性扩增避免非特异性扩增 提高提高PCR反应的反应的特异性特异性用用 途途 基因组扩增基因组扩增 RT-PCR11 热启动热启动 Taq酶酶特异性特异性产产 品品 类类 型型产产 品品 名名 称称产产 品品 性性 能能化学修饰化学修饰 天为时代天为时代:HotStart Taq Roche:FastStart Taq Abgene:Thermo-start DNA Polymerase Stratagene:SureStart Taq 大大提高大大提高PCRPCR反应的特异性反应的特异性 化学修饰不影化学

5、修饰不影响后续实验响后续实验抗体抑制抗体抑制 Invitrogen：AccuPrimeTM Taq Platinum Taq TaKaRa：ExTaqTM HotStart Version 蜡封蜡封 Promega：TaqBeadTM HotStart 12保真性保真性 高保真酶高保真酶原原 理理用用 途途 35核酸核酸表达基因的克隆表达基因的克隆基因的定点突变基因的定点突变 细胞内基因点细胞内基因点突变分析突变分析（SNPSNP）外切酶活性外切酶活性 降低碱基错配率降低碱基错配率 13保真性保真性 高保真酶高保真酶产产 品品 类类 型型生生 物物 公公 司司性性 能能 比比 较较PfuDNA

6、 Polymerase 天为时代天为时代 Stratagene Promega在目前已发现的所有在目前已发现的所有耐热聚合酶中耐热聚合酶中,Pfu,Pfu保保真度最高碱基错配率真度最高碱基错配率最低最低PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRaTli DNA PolymerasePromega14 高保真高保真 高扩增效率高扩增效率原原 理理 混合酶混合酶高扩增效率高扩增效率 35核酸外切核酸外切用用 途途 超长片段扩增超长片段扩增 测序测序 构建基因图谱构建基因图谱 复杂模板扩增复杂模板扩增GC含量高含量高二级结构二级结构15 高保真高保真 高扩增效率高扩增效率特特 点

7、点 产产 品品性性 能能高扩增效率高扩增效率天为时代天为时代：Taq Plus TaKaRa：Ex TaqTM 复杂模板扩增复杂模板扩增高保真高保真天为时代天为时代：Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity 保真度低于保真度低于PfuPfu聚合酶聚合酶但扩增效率较高但扩增效率较高 长片段扩增长片段扩增天为时代天为时代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 特别适用于保真度较特别适用于保真度较高的高的 超长片段扩增超长片段扩增16PCR M

8、asterMix原原 理理预配好的预配好的PCR反应反应液液 DNA聚合酶聚合酶 反应缓冲液反应缓冲液 dNTPdNTP PCR增强剂增强剂 17PCR Master Mix特特 点点 快速简便快速简便 减少加样误差和污染减少加样误差和污染 灵敏度高灵敏度高 可扩增低至可扩增低至2 2个拷贝的目的模板个拷贝的目的模板 特异性强特异性强 降低降低PCRPCR反应的要求，反应的要求，增强特异性增强特异性 稳定性好稳定性好 长期放置活性无改变长期放置活性无改变适用范围适用范围 大规模基因检测大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高含量高,有二级结构的模板有二级结构

9、的模板 复杂基因组样本复杂基因组样本 可直接检测菌落，基因点突变检测可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。或者阳性克隆的筛选。18PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案19 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性20无扩增产物模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer对样品不合适对样品不合适引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时

10、间太短伸时间太短 原原因因对对策策纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；21 非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者

11、同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。22引物特异性差引物特异性差模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高酶量过多酶量过多MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高退火温度偏低退火温度偏低循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度适当减少酶量适当减少酶量降低镁离子浓度降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增23 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 224模板不纯模板不纯BufferBuff

12、er不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策纯化模板纯化模板更换更换BufferBuffer适当提高退火温度适当提高退火温度适量用酶适量用酶适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度减少循环次数减少循环次数 拖尾25 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心

13、轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。26PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略27巢式巢式PCR（Nest-PCR）递减递减PCR（TouchDown PCR）热启动热启动PCR（HotS

14、tart PCR）使用使用PCR增强剂增强剂28巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的灵敏度，的灵敏度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。29递减递减PCR（TouchDown PCR）递减递减PCR通过在通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的

15、特异性。循环设在比估算的TmTm高大约高大约5的退火温度下开始，的退火温度下开始，然后每个循环降低然后每个循环降低1 1-2 2,直到退火温度低于直到退火温度低于Tm Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。循环中继续扩增占据优势。递减递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。30热启动热启动PCR（HotStart PCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟热启动主要是通过抑制一

16、种基本成分延迟DNA合成，合成，直到直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度；现在有很多公司都有现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异特异性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。31使用使用PCR增强剂增强剂 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助助DNA聚合酶延伸通过二级结构区聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 32谢谢！谢谢！