DNA印迹与杂交技术

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1、固相杂交固相杂交二、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。已知核酸序列称探针。Hybridization of Nucleic AcidsRNADNA1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridization探针探针 DNA变性变性 1、定义：某些理化因素导致两条、定义：某些理化因素导致两条DNA链

2、间的链间的氢链断裂变为单链的过程，称氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性。变性。2、变性的方法：、变性的方法：（1）热变性：温度升高到）热变性：温度升高到90100时，双链核酸时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：）酸碱变性：pH值低于值低于3或高于或高于10时，双链核时，双链核 酸分子链酸分子链 间的氢键断裂。间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。双链核酸分子链间的氢键断裂。3、变性后的理化性质变化：、变性后的理化性质变化：粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外

3、吸收值增加紫外吸收值增加 复性复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、复性过程、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链

4、周围的碱基如配对，则形成中心序列）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子）形成完整的双链分子 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNADNA或或RNARNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印吸印”上去的，因此，核酸上去的，因此，核酸杂交也被称为杂交也被称为“DNADNA印迹杂交印迹杂交”。材料：材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙

5、基纤维素滤膜（DEAE）步骤：步骤：第一第一 将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上核酸印迹转移核酸印迹转移电泳凝胶核酸印迹法、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法菌落和噬菌斑印迹法第二第二 是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或或RNA探针进行杂交探针进行杂交 杂杂 交交 模模 式式 图图放射自显影DNA印迹转移探针杂交（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因

6、DNA片段片段X光底片光底片步骤解析步骤解析 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 凝胶置于凝胶置于NaOH溶液中使溶液中使DNA变性断裂变性断裂为较短的单链为较短的单链 DNA，中性缓冲液中和凝胶中，中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。的缓冲液。4.1 固相支持物的选择固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能具有良好的机械性能 非特异

7、吸附少非特异吸附少4.2 常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是底低。缺点是DNA分子结合不牢固分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同与膜共价结合；对不同 大小的大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低力较上述两种膜低4.3 Southern印迹的常用方法印

8、迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。其基本原理是：容器其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。片段移出凝胶而滞留在膜上。

9、（2）电转法）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到转移到固相支持物上。固相支持物上。（3）真空转移法）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。各种转移方法的比较各种转移方法的比

10、较 i)毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低移仪器，但转移效率低,（扩散法为（扩散法为70%，毛细管法毛细管法80%）耗时多。）耗时多。ii)电转移法：效率高，耗时少，需特殊转电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。移仪，对转移条件要求较严。iii)真空转移法：效率高，耗时最少，需特真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。殊真空转移仪。转移的最佳条件转移的最佳条件 i)固定基质的选择固定基质的选择 ii)转移前预处理：转移前预处理：DNA和和RNA分子变性，蛋白质分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的则需除去凝胶中的

11、SDS。iii)大分子的转移大分子的转移对于分子量较大的对于分子量较大的DNA片段，必须进行片段，必须进行原位断裂原位断裂后再进行转移，断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为分子最佳长度为1-2kb。其步骤是：其步骤是：0.25M HCl处理凝胶两次（每次处理凝胶两次（每次15分钟）分钟）水洗水洗0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次两次，每次15分钟分钟转移。转移。5、Southern杂交杂交 1、预杂交：封闭膜上能与、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点结合的位点 预杂交液为不含预杂交液为不含DNA探针的杂交液探针的杂交液 2、杂交：液相中的、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测

12、探针与膜上的待测DNA杂交杂交 双链双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA 化学显色或放射自显影标记的标记的探针探针探针探针 探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的识别性探针技能，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫而实现对后者进行检测的一种技能，我们把标记的分子叫探针（探针（Probe）从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有从化学和生物学意义上理解，探针是一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分

13、子反应。如抗供反应后检测的合适标记物，并与特异靶分子反应。如抗体体-抗体、外源凝集素抗体、外源凝集素-碳水合合物、亲合素碳水合合物、亲合素-生物素、受生物素、受体体-配基（配基（Ligand）以及互补核酸间的杂交均属于探针）以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶靶分子反应。分子反应。（一）探针的种类（一）探针的种类 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针（二）标记物（二）标记物理想标记物应具备的特性：理想标记物应具备的特性：高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对

14、酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性 标记物种类标记物种类 核素标记物：核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物非核素标记物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 （三）标记方法（三）标记方法 体内标记法：体内

15、标记法：将核素标记的化合物作为合成将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新核素掺入到新合成的核酸分子中，如合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到胸苷可掺入到DNA中，中，3H-尿苷可掺入到尿苷可掺入到RNA中中 体外标记法：体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应，探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸后利用酶促法将标记的核苷

16、酸 掺入到探针上掺入到探针上 酶促标记法酶促标记法切口平移法（切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外核酸外切酶活性在切口处将旧链从切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以互补的互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到切连接到切口的口的3 末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA链，同时链，同时将标记的核苷酸掺入到新的将标记的核苷酸掺入到新的DN

17、A链中链中随机引物法随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，模板结合，作为合成新链的引物，在作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与链，其核苷酸序列与模板模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样合成模板同样合成一条新的完全互补的一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中分子中随机引物法所具有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单

18、链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记（四）探针的纯化（四）探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可片段，可去除去除dNTP和蛋白质和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子大分子DNA和小分子和小分子

19、dNTP、磷酸根离子及寡核苷、磷酸根离子及寡核苷酸（酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针法则是利用离心的方式来纯化探针 四、影响杂交的因素四、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加单链

20、探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度过高影响杂，浓度过高影响杂 交效率交效率2、温度：、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较杂交，适宜温度较Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低杂交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低值低5 3、离子强度：、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进）高浓度的盐使碱基错配的杂交体

21、更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺：、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 杂交杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在液在68杂交杂交 5、

22、核酸分子的复杂性：、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度；的总长度；（2）两个）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性。6、非特异性杂交反应：、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分和高分子化合物。如鲑精子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，

23、Denharts溶液或脱脂奶粉。溶液或脱脂奶粉。固相杂交固相杂交（一）（一）Northern印迹杂交印迹杂交 1、Northern blot印迹杂交是指待测印迹杂交是指待测RNA样品经样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固酸探针进行固-液相杂交。液相杂交。2、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 3、鉴别、鉴别RNA 4、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 5、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNA Isolate mRNA (Different Lengths)P

24、robe with labeled DNANorthern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性：、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态，处于变性状态，DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性 2、转膜：、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA特异性不高、不能鉴别核酸分子量特异性不高、不能鉴别核酸分子量由原位杂交发展起的一些新技术由原位杂交发展起的

25、一些新技术多色多色FISH（M-FISH技术）技术）荧光原位杂交荧光原位杂交n指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。分子的过程。一）一）RNA酶保护分析法酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的单专一水解杂交体系中的单链链RNA，不水解探针，不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成互补形成的双链的双链RNA，使杂交分子得到保护，称，使杂交分子得到保护，称RNA酶酶保护分析法。保护分析法。2、杂交过程、杂

26、交过程 制备待测制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记记RNA探针探针 杂交：待测杂交：待测RNA与与RNA探针在液相中杂交探针在液相中杂交 RNaseA和和RNaseTI除去单链除去单链RNA 电泳分离电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果放射自显性检测杂交结果二）核酸酶二）核酸酶S1保护分析法保护分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中在一定条件下专一水解杂交体系中的单链的单链DNA和单链和单链RNA，不水解，不水解DNA探针与待测探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶称核酸酶S1保护分析法保护分析法2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA：总：总RNA或或mRNA均可均可 单链单链DNA探针的制备与标记探针的制备与标记 杂交：单链杂交：单链DNA探针与待测探针与待测RNA在液相中杂交在液相中杂交 核酸酶核酸酶S1除去单链除去单链DNA和单链和单链RNA 电泳分离电泳分离DNA/RNA杂交体分子杂交体分子 放射自显影检测杂交结果放射自显影检测杂交结果