测定蛋白含量方法

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1、标准曲线制作一考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查 出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4， 雍蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO

2、4O2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。2、移液管使用（）。（三）、标准曲线制作：1、试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl （ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂（ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照，在595nm处比色A 595nm2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20

3、 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线。1）、利用标准曲线查出回归方程。2）、用公式计算回归方程。3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=aXX（ ）+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.1-0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测

4、A595nm值，然后再计算。（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步骤（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器。2、洗涤。（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1）、G/V 比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml水。2）、V/V 比：例如配 75%乙醇 100ml, 75%X100%=100%XX, X=75ml。取 75ml 无水乙醇， 加25ml蒸馏水。乙醇：乙醚：丙酮=2： 1： 2配500ml,各取200 ml

5、, 100 ml, 200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。1 ）、0.1M 或 0.1mol/L NaCl 配 100ml。M=质量/体积（L）称取NaCl0.1X0.1X40=0.4g 摩尔数=G （g） /摩尔质量2）、0.1mMNaCl 配 100mlmM=毫摩尔数/体积（L）称取 NaCl0.1X0.1X40=0.4g毫摩尔数=6 （mg） /摩尔质量3）、0.1uNaCl 配 100mlmM=摩尔数/体积（L）称取 NaCl0.1X0.1X40=0.4mg微摩尔数=6 （ug） /摩尔质量称取N

6、aCl0.1X0.1X40=0.4ug3、混合溶液配制的计算：如配 3uMEDTA, 2.25mM NBT 以及 60uM溶液 100ml，用 50mM 磷酸缓冲液配制。注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml（三）、标量：1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液 管。2、电子分析天平的使用。（四）、溶解：1、根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。2、只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤 烧杯三次左右，直到洗涤干净。小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和 所学

7、的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如： 配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90oC），过量会糊化。（五）、定容：1、用容量瓶定容；2、用玻璃棒引流或用小漏斗；3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切 为止（眼睛可视）；4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。（注意不再定容了，防止溶液漏掉。）（六）、装入试剂瓶，贴上标签。标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日

8、期等。（七）、清理实验场所。二、磷酸缓冲液的配制。（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠一磷酸二氢 钠做缓冲液。选用药品：Na2HPO4 - 12H2O （碱）和 NaH2PO4 - 12H2O （酸）配缓冲液 100ml。 书中说明。（二）、计算：1、注：书中有注明配置的量。2、计算：Na2HPO4 - 12H2O 称取 71.64 X0.1=7.164gNaH2PO4 - 12H2O 称取 31.21 X0.1=3.121g3、含有不同结品水的换算。书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2HPO4 2H2O需要11.87g/L但用Na2H

9、PO4 12H2O 需多少 g?11.87= （178/358）XX, X=23.87g。（三）、分别配制缓冲液各100ml （根据需要确定配制的量）。即：0.2M Na HPO 2H O 和 NaH PO 2H O100mlo242242（四）、按书中的量配制取量再混合。如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml，以你配制的母液稀释即可。计算：50X0.1=0.2X1000XX （L）； X =0.025L；取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。