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1、货号：MS1110规格：100管/96样硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase,TrxR ）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于毗啶核苷酸-二硫化物氧化还 原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似， 催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。测定原理：TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长 处TNB的增加速率，即可计算
2、TrxR活性。自备仪器和用品：低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。试剂组成和配制：试剂一：液体X1瓶，4C保存。试剂二：粉剂X1瓶，4C避光保存。临用前加入2mL蒸馏水溶解。试剂三：粉剂X1管，4C保存。临用前加入2mL蒸馏水溶解。粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）:试剂一体积（mL）为1： 510的比例（建议称取约0.1g组织，加 入血1试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4C离心 10min，取上清置冰上待测。2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为5001000： 1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一
3、），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4C,离心 10min，取上清置于冰上待测。3. 血清等液体：直接测定。TrxR测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。2. 试剂一在25 C（ 一般物种）或者37C（哺乳动物）预热30min。3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20p L试剂二，20p L试剂三，160 L试剂一， 迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A1和A2OAA空白管二A2-A1。4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20p L试剂二，20p L
4、试剂三，140 L试剂一， 20p L上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。AA测定管二A4-A3。注意：空白管只需测定一次。TrxR活性计算公式：（1）.按蛋白浓度计算活性单位定义：在25C或者37C中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/min/mg prot） = （AA测定管-空白管）： :dXV反总：（CprXV样）：T=147X（A测定管-AA空白管）：Cpr（2）.按样本质量计算活性单位定义：在25C或者37C中，每克样本每分钟催化1 nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/mi
5、n/g） = （AA测定管-AA空白管）： :dXV 反总：（WXV 样：V 样总）：T =147X（AA测定管-AA空白管）：W（3）按细胞数量计算活性单位定义：在25C或者37C中，每104个细胞每分钟催化1 nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/min/104cell） = （AA测定管-AA空白管）： :dXV反总：（细胞数量XV样：V 样总）：T=147X（AA测定管-AA空白管）：细胞数量（4）按液体体积计算活性单位定义：在25C或者37C中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/min /mL） = （AA 测定管
6、-AA 空白管）： :dXV 反总：V 样：T=147X（AA测定管-AA空白管） : TNB在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136 L/p mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V反总： 反应体系总体积（L），200p L=2X10 -4 L； Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测 定；W :样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20p L=0.02 mL； V样总：提 取液体积，1 mL； T：反应时间（min）， 5 min。b.使用96孔板测定的计算公式如下（1）.按蛋白浓度计算活性单位定义：在25C或者37C中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DT
7、NB还原为1个酶活单位。 TrxR （nmol/min/mg prot） = （AA测定管-AA空白管）： :dXV 反总-F （CprXV 样）：T=294X（AA测定管-AA空白管）FCpr（2）.按样本质量计算活性单位定义：在25 C或者37C中，每克样本每分钟催化1 nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/min/g） = （AA测定管-AA空白管）： :dXV 反总F（WXV 样：V 样总）FT =294X（AA测定管-AA空白管）FW（3）按细胞数量计算活性单位定义：在25C或者37C中，每104个细胞每分钟催化1 nmol DTNB还原为1个酶活单位。 Trx
8、R （nmol/min/104cell） = （AA测定管-AA空白管）： :dXV 反总F （细胞数量XV样：V 样总）FT= 294X（AA测定管-AA空白管）：细胞数量（4）按液体体积计算活性单位定义：在25C或者37C中，每毫升液体每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR （nmol/min/mL） = （AA测定管-AA空白管）： FdXV 反总：V 样：T=294X（AA测定管-AA空白管） : TNB在412nm处的微摩尔消光系数，0.0136 L/p mol/cm； d： 96孔板光径，0.5cm； V反 总：反应体系总体积（L），200p L=2X10-4L； Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外 测定；W :样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20p L=0.02 mL； V样总： 提取液体积，1 mL； T：反应时间（min）， 5 min。注意事项：1. 测定前须先取12个样做预实验，使得吸光值在5min内程线性变化。哺乳动物组织及 血液制品TrxR活力测定时，一般须用蒸馏水稀释5倍左右；测定过程操作须迅速。2. 试剂二和试剂三配制好后3天内使用完。
硫氧还蛋白氧化还原酶试剂盒说明书
