蛋白质含量的测定

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1、蛋白质含量测定法有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin 酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝 法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020 倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定 的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一 种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美 无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑

2、：实验对测定所要求的灵敏度和精确度; 蛋白质的性质：溶液中存在的干扰物质：测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫 酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度 可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 t2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 （1）NH22NH3 + H2SO4 -（NH4）2SO4（NH SO + 2NaOH t 2H O +

3、Na SO + 2NH（3）4242243反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用 硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6. 25即得。五种蛋白质测定方法比较如下:方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白(Kjedahl适用于0.2810为氨，用酸吸（可用三氯质含量的准确法）1.0mg 氮，误差为2%

4、小时收后滴定乙酸沉淀蛋 白质而分 离）测定；干扰少； 费时太长双缩脲法（Biuret 法）灵敏度低1 20mg中速2030分钟多肽键+碱性Cu2 +r紫色络 合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测 定，但不太灵 敏；不同蛋白 质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100艇快速510分钟蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸 残基在280nm 处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流 出液的检测； 核酸的吸收可 以校正Folin 一酚试 剂法（Lowry 法）灵敏度高5g慢速40 60分钟双缩脲反应；磷钼酸一磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要

5、严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法（Bradford法）灵敏度最高15g快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其* max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180r左右加热，放出一个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有 两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 有双缩脲反应。H2OC=oO=C、HN

6、-“ NHR-CH 、. LH-Ro=C: Cu ： ： _C=OHn 广- nHR-Ch!CH-R1HO12紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无 关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要 有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主 要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测 定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成 10mg/ml的标准蛋白溶

7、液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有 需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据 其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白 用 0. 05N NaOH 配制。（2 ）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4 - 5H2O ）和6.0克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6 - 4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液， 用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2, 器材：可见光

8、分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫 升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后， 在室温（2025C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收 值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。 注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵

9、敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于 其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此 法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以 增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是： 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐 一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学 领域得到广泛的应用。这个测

10、定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费 时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干 扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的 影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干 扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%）， 乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时， 必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。 若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠一氢

11、氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加F olin一酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳 定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜一蛋 白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸一磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即 能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5吒。通常测定范围是20250吒。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克Na CO，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaCHO - 4H G）o234 4 62溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSG45H2G）溶解于1

12、00毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入 100克钨酸钠（Na2WG4 - 2H2G） ,25克钼酸钠 （Na2MoG4 - 2H2G）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充 分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸 锂（Li2SG4）， 50毫升蒸馏水及数滴液体漠，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的漠。冷却后溶液 呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体漠的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕 色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚欧作指示剂，然后适当稀释，约加

13、水1 倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或 L球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 |ig/ml左右。 牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2,器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1,标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分 成两组，分别加入0，0.1，0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250口g/ml）。 用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于 室温（2025C ）放置10分钟。

14、再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立 即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟， 以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度 值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即 第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲， 2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1 支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后 加第3

15、支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测 定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面 的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管 加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin-酚试剂法实验表格：管号12345678910标准蛋白质（250g/ml）未知蛋白质00.10.20.40.60.81.00.20.40.6(约 250g/ml)蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4试剂甲5.05.05.05.05.05.05.

16、05.05.05.0试剂乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白质的量（瞄）吸光度值（a700)2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法 进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的 测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表 中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶 液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的 蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相

17、对浓度（相对于标准蛋白 质）。四、改良的简易Folin酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05% 硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温 放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55C恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后， 在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与Folin-酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果

18、。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促 使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结 合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到 广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置 (人max)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料 主要是与蛋白质中的碱性

19、氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：(1) 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1|ig。这是 因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高的消光系 数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2) 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。 由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持 稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样 费

20、时和严格地控制时间。(3) 干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：(1) 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用y一球蛋白为标准蛋白 质，以减少这方面的偏差。(2) 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、 十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。(3) 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进

21、行计算，而只能用标准 曲线来测定未知蛋白质的浓度。(二)试剂与器材1. 试剂：(1) 标准蛋白质溶液，用y一球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和 0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。(2) 考马斯亮兰G250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 95% 的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2, 器材：(1) 可见光分光光度计(2) 旋涡混合器(3) 试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序， 分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别

22、加入：0、0.01、 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入 5.0ml考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧 烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm 处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后 立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙

23、酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格:管号12345678910标准蛋白质0（1.0mg/ml）未知蛋白质0.010.020.040.060.080.100.020.040.06(约 1.0mg/ml)蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考马斯亮蓝G250 试剂 5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋 白质量（ig） 光吸收值(A595)（3）用标准蛋白质量（jig）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到 一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋 白质含量。0.5mg牛血

24、清蛋白/ml溶液的A 约为0.50。2,微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100ig/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到 0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O,考马斯亮蓝G250试剂仍加 5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具 有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成 正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋 白

25、质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐， 例如生化制备中常用的（nh4）2so4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析 洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋 白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误 差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌吟、嘧 啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正

26、表，再 进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同 的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因 此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋 白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最 常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓 冲液）作空白对照，在紫

27、外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可 控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的 蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1%1cm ）有文献数据可查，根据 此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与01%面）值（即 蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1%：称为百分 吸收系数或比吸收系数。Cm,蛋白质浓度=（A280X10 ）/ A1%1cm,280nm（畔啊（1% 浓度 10mg/ml）例：牛

28、血清清蛋白：A1%1cm=6.3 （280nm）溶菌酶：Ai%1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1% 值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含 1cm量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/m 1。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号123456BSA (1.0mg/ml)01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00A280用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280,以 A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或

29、蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线， 利用此标准曲线，根据测出的未知样品的a280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也 可以用2至6管A,s值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1%, 2801cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸 在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm 处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260- 1.8纯核酸的光吸收比值：A280/A

30、260 x 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其a280和a260，由此吸收差值，用下面的经验 公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45XA2800.74X A260 （mg/ml）此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵 母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与 225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20100 pg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液， 分别测定215nm和225nm

31、的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差= A215 a225以吸收差为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸 收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20100pg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、 (NH4)2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其 浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋 白质溶液配制一系列5

32、0500pg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收 值a238，以a238为纵座标，蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即 可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类 和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有 机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后 再作测定。参考文献1、Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, 55-59页2、蔡武成、袁厚积主编：生物物质常用化学分析法，1982年，9399页3、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著，生化实验方法和技术，1981年，164169页，高等教育出版社4、Bradford M.Anal Biochem ,72,248(1976)